CD4+CD25+调节性T细胞及其相关因子在恶性肿瘤患者胸腔积液及外周血中的表达

罗玲娟,张立平,谢新梅,张洪亮

(新疆医科大学附属中医医院肿瘤二科, 新疆 乌鲁木齐　830000)



CD4+CD25+调节性T细胞及其相关因子在恶性肿瘤患者胸腔积液及外周血中的表达

罗玲娟,张立平,谢新梅,张洪亮

(新疆医科大学附属中医医院肿瘤二科, 新疆 乌鲁木齐830000)

目的：探讨CD4+CD25+调节性T细胞及其相关因子在恶性肿瘤患者胸腔积液及外周血中的表达。方法：选取42例恶性肿瘤胸腔积液患者为研究组，38例健康体检者为对照组，采用流式细胞仪(FCM)和酶联免疫法(ELISA)检测研究组胸腔积液和外周血、对照组外周血中CD4+CD25+/CD4+比例、淋巴细胞亚群以及转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素-10(IL-10)和干扰素-γ(IFN-γ)水平。结果：研究组胸腔积液及外周血中CD4+CD25+/CD4+比例及TGF-β1、IL-10水平均显著高于对照组(P<0.01)，且胸腔积液高于外周血(P<0.01)，而IFN-γ水平显著低于对照组，且胸腔积液低于外周血(P<0.01)。结论：对恶性肿瘤患者外周血和胸腔积液中CD4+CD25+调节性T细胞及TGF-β1、IL-10和IFN-γ水平进行检测有利于判断病情预后和转归。

CD4+CD25+;调节性T细胞;抑制因子;胸腔积液;免疫

调节性T细胞是一类具有免疫抑制功能的T细胞亚群，主要通过细胞-细胞直接接触的方式发挥免疫抑制效应，T细胞的活化、增殖或异常表达能调节获得性免疫系统，会引发疾病不同的发展，阻止自身免疫疾病的发生[1]。其以自然产生的CD4+CD25+调节性T细胞研究最多，调控效能主要限于CD4+CD25+亚型[2]。由于调节性T细胞独特的生物学功能，其在自身免疫性疾病的发生、肿瘤发生与转归上越来越受到重视，且在慢性感染性疾病中的作用成为近年来免疫学研究的热点[3-4]。本研究通过检测恶性肿瘤患者外周血和胸腔积液中CD4+CD25+调节性T细胞的表达，探讨其机制及变化，现报告如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2013年4月至2015年2月新疆医科大学附属中医医院收治的恶性肿瘤胸腔积液患者42例为研究组，均经组织病理学或细胞学确诊为恶性肿瘤，且胸腔积液中检出癌细胞，其中男23例，女19例；平均年龄(38.21±13.87)岁。另选取健康体检者38例为对照组，其中男20例，女18例；平均年龄(37.71±12.63)岁。

1.2方法

1.2.1实验试剂异硫氰酸荧光素FITC标记的小鼠抗人CD4抗体，藻红蛋白PE标记的小鼠抗人CD25抗体，PE-Cy-CD4同型阴性对照试剂(以上试剂均购于Beckman-Coulter公司，于4 ℃保存备用)；转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的ELISA试剂盒(BioSource公司)。

1.2.2细胞制备采集研究组患者中静脉血10 mL，加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，梯度离心分离淋巴细胞，1640培养基洗涤2次，再以含1%胎牛血清的1640培养基重悬细胞并计数，稀释细胞浓度至1×106/mL，取1 mL细胞悬液置于试管中。以1 500 rmp离心10 min后，弃上清，分别取FITC标记的CD4+抗体和PE标记的CD25+抗体20 μL。分别加入单抗后于4 ℃中避光孵育30 min，加1%BSA-PBS液离心并洗涤，重复2次，稀释至300 μL。对照组经相同处理，稀释至300 μL并移入试管中，待检测分析。

1.2.3检测方法①采用Becton Dikisob FACS Gablibur流式细胞仪测定淋巴细胞标记后荧光强度。荧光强度以二维dot-plot散点图自动分析，结合某一单抗的阳性细胞个数和百分比，在FITC-CD4/PE-CD25双参数图上计算CD4+CD25+T细胞比例。CD4+CD25+T细胞(%)=(CD4+CD25+T细胞数)/CD4+T细胞数×100%；②采用酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测两组TGF-β1、IL-10和IFN-γ水平，严格按照试剂盒说明操作，并测光密度(optical density，OD)值。以标准品含量为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算样本浓度，以pg/mL为单位。对照组采集检测同上。

1.3统计学方法

2　结果

2.1两组调节性T细胞检测结果比较

研究组胸腔积液和外周血中CD4+CD25+/CD4+比例明显高于对照组(P<0.01)；研究组胸腔积液中CD4+CD25+/CD4+比例显著高于外周血，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1　两组调节性T细胞检测结果比较±s)

*P<0.01，与对照组比较； #P<0.01，与外周血比较。

2.2两组TGF-β1、IL-10和IFN-γ水平比较

研究组胸腔积液及外周血中TGF-β1、IL-10水平显著高于对照组，且胸腔积液高于外周血，而IFN-γ水平显著低于对照组，且胸腔积液低于外周血，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2　两组TGF-β1、IL-10和IFN-γ水平比较

*P<0.01，与对照组比较； #P<0.01，与外周血比较。

3　讨论

调节性T细胞是一类负向免疫细胞，CD4+CD25+调节性T细胞具有免疫无能性和免疫抑制性两大特点[5]。免疫无能性表现在受到抗原刺激后，既不增生也无IL-2分泌等T细胞活化现象；免疫抑制性表现为能抑制CD4+、CD8+T细胞亚群，可产生TGF-β1、IL-10等抑制性细胞因子，调节效应T细胞，经细胞接触、竞争抑制等方式发挥作用，通过影响细胞凋亡和增殖过程来影响机体的天然免疫和获得性免疫[6-8]。同时，其可抑制IFN-γ的产生，这一过程在抑制自身免疫疾病的产生的同时也参与肿瘤免疫调节[9]。

研究[10]发现，CD4+CD25+调节性T细胞能抑制CD4+、CD8+T淋巴细胞、自然杀伤T细胞(natural killer T cells，NKT细胞)、B淋巴细胞、树突细胞以及单核/巨噬细胞的分化，并能影响这些细胞的效应功能。机体内抗原被CD4+CD25+调节性T细胞识别后，调节性T细胞活化进而发挥免疫作用，影响疾病预后[11]。本研究通过检测恶性胸腔积液患者胸腔积液及外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的分布，发现研究组胸腔积液和外周血中CD4+CD25+/CD4+比例明显高于对照组，且胸腔积液中CD4+CD25+/CD4+比例显著高于外周血，表明CD4+CD25+调节性T细胞可能参与了恶性肿瘤的发病，且CD4+CD25+调节性T细胞更易被趋化至胸腔积液中，与陈一强等[12]研究结果一致，提示CD4+CD25+调节性T细胞可作为患者免疫状态、疗效观察的指标，对临床指导有一定价值。

IL-10和TGF-β1可诱导针对肿瘤特异性抗原的免疫耐受，通过外周耐受抑制自身反应性T细胞活性的机制，影响自身免疫系统的应答[13]。本研究结果显示，研究组胸腔积液及外周血中TGF-β1、IL-10水平显著高于对照组，且胸腔积液高于外周血，说明细胞因子与患者的免疫调节功能有关；而IFN-γ水平低于对照组，且胸腔积液低于外周血，说明CD4+CD25+调节性T细胞能抑制IFN-γ的表达。由此可见，CD4+CD25+调节性T细胞扮演着重要的免疫调节角色，可能直接参与了肿瘤的进展，影响病程发展，且比例增高预示着患者胸腔局部免疫反应存在抑制状态。因此，下调CD4+CD25+调节性T细胞有助于提高机体抗肿瘤免疫[14-15]。

综上所述，对恶性胸腔积液患者外周血和胸腔积液中CD4+CD25+调节性T细胞及TGF-β1、IL-10和IFN-γ水平进行检测有利于判断病情预后和转归，有望为判断病情发展、实施有效干预提供新的思路。

[1]程爱荣,程焱,孙保亮.调节性T细胞及其免疫抑制机制[J].中国临床神经科学,2014,22(4):438-444.

[2]贾秀杰,蔡珊.CD4+CD25+调节性T细胞在呼吸系统疾病中的作用研究[J].国际呼吸杂志,2014,34(9):701-704.

[3]Pedros C,Duguet F,Saoudi A,etal.Disrupted regulatory T cell homeostasis in inflammatory bowel diseases[J].World J Gastroenterol,2016,22(3):974-995.

[4]Liu C,Workman CJ,Vignali DA.Targeting Regulatory T Cells in Tumors[J].FEBS J,2016,doi:10.1111/febs.13656.

[5]Guasti L,Maresca AM,Schembri L,etal.Relationship between regulatory T cells subsets and lipid profile in dyslipidemic patients:a longitudinal study during atorvastatin treatment[J].BMC Cardiovasc Disord,2016,16(1):26.

[6]Bates GJ,Fox SB,Han C,etal.Quantification of regulatory T cells enables the identification of high-risk breast cancer patients and those at risk of late relapse[J].J Clin Oncol,2006,24(34):5373-5380.

[7]赵丹彤,闫惠平.CD4+CD25+调节性T细胞与自身免疫性肝病研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2009,25(3):282-284.

[8]Zielinski CE,Mele F,Aschenbrenner D,etal.Pathogen-induced human TH17 cells produce IFN-γ or IL-10 and are regulated by IL-1β[J].Nature,2012,484(7395):514-518.

[9]黄小琪,林英辉,陈松林,等.结核性胸膜炎患者外周血及胸水中CD4+CD25+CD127-调节性T细胞表达水平的临床意义[J].细胞与分子免疫学杂志,2011,27(4):448-449.

[10]Sitrin J,Ring A,Garcia KC,etal.Regulatory T cells control NK cells in an insulitic lesion by depriving them of IL-2[J].J Exp Med,2013,210(6):1153-1165.

[11]Chen WJ,Wahl SM.TGF-β:the missing link in CD4+CD25+regulatory T cell-mediated immunosuppression[J].Cytokine Growth Factor Rev,2003,14(2):85-89.

[12]陈一强,施焕中,覃雪军,等.恶性胸腔积液中CD4+CD25+调节T淋巴细胞的测定[J].中华结核和呼吸杂志,2007,30(8):609.

[13]Facciabene A,Motz GT,Coukos G.T-regulatory cells:key players in tumor immune escape and angiogenesis[J].Cancer Res,2012,72(9):2162-2171.

[14]林静,酉鹏华,程功,等.CD4+CD25+调节性T细胞对ox-LDL诱导的小鼠巨噬细胞焦亡的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2015,13(8):976-979.

[15]张剑英,刘班,张毅敏,等.宫颈癌患者外周血中调节性T细胞的变化及其临床意义[J].中华微生物学和免疫学杂志,2015,35(10):753-758.

(学术编辑：赵妍丽)

Expression of CD4+CD25+regulatory T cells and their relevant factors in pleural effusion and peripheral blood of patients with malignant tumors

LUO Ling-juan,ZHANG Li-ping,XIE Xin-mei,ZHANG Hong-liang

(SecondDepartmentofOncology,TraditionalChineseHospitalAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity,Urumchi830000,Xinjiang,China)

Objective：To explore the expression of CD4+CD25+regulatory T cells and their relevant factors in pleural effusion and peripheral blood of patients with malignant tumors.Methods：Forty-two patients with malignant pleural effusion were selected as the research group,and 38 healthy people were selected as the control group.The CD4+CD25+/CD4+proportion,lymphocyte subsets,levels of transforming growth factor-β1 (TGF-β1),interleukin-10 (IL-10) and interferon-γ (IFN-γ) in pleural effusion and peripheral blood in the research group as well as peripheral blood in the control group were detected using flow cytometry (FCM) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results：The CD4+CD25+/CD4+proportion,levels of TGF-β1 and IL-10 in pleural effusion and peripheral blood in the research group were significantly higher than those in the control group (P<0.01),but all the above markers in pleural effusion were prominently higher than those in peripheral blood (P<0.01).In the research group, the levels of IFN-γ in pleural effusion and peripheral blood were notably lower than those in control group,in which those in pleural effusion were lower (P<0.01).Conclusion：Detection of CD4+CD25+regulatory T cells and levels of TGF-β1,IL-10 and IFN-γ in pleural effusion and peripheral blood of patients with malignant tumors is conductive to judging the disease prognosis and outcome.

CD4+CD25+;Regulatory T cells;Inhibitors;Pleural effusion; Immune

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.036

2016-01-16

罗玲娟(1981-)，女，硕士，主治医师。E-mail：Lt7912@126.com通讯作者:张洪亮，E-mail: zhanghongliang@csco.cn

时间：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.072.html

1005-3697(2016)03-0413-03

R730.2

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