miR-223基因家族的分子进化与靶基因预测

钟晓武，青玉凤，杨其彬，何泳龙，赵明才，谢文光，周京国

(川北医学院附属医院 1.检验科；2.风湿免疫科；3.医学研究中心，四川 南充　637000)



miR-223基因家族的分子进化与靶基因预测

钟晓武1，3，青玉凤2，杨其彬2，何泳龙2，赵明才1，3，谢文光1，周京国2

(川北医学院附属医院 1.检验科；2.风湿免疫科；3.医学研究中心，四川 南充637000)

目的：分析所有miR-223基因家族成员的序列特征，并对miR-223靶基因进行预测，然后分析miR-223靶基因的生物学功能。方法：利用Clustal X 1.83软件分析miR-223基因序列特征，MEGA 5.0软件分析进化关系，再运用TargetScan、PicTar和miRDB进行靶基因预测，最后GO和KEGG进行功能分析。结果：在miRBase数据中获得 miRNA-223基因家族成员的序列27条，绝大部分位于基因间隔区，少数成员的基因位置未知。大部分定位于X染色体，部分成员位于常染色体。miRNA-223成熟序列长度在20-23nt之间，同源性较高。系统进化树分析表明，miRNA-223基因家族成员分为三支。预测获得人类miRNA-223的可能具有27个靶基因，它们主要与信号转导、转录调控以及细胞生长发育等密切相关。结论：本研究结果不仅有利于理解miR-223基因家族的生物学功能，也可为后续研究提供理论依据。

miRNA-223；分子进化；靶基因；功能分析

miRNAs是一类大小约20～25个核苷酸的内源性非编码小分子，广泛存在于病毒，植物，人类等真核生物[1]。早在1993年，Lee等[2]从线虫中发现了第一个小RNA—lin-4。之后，Reinhart等[3]发现了第二个小RNA—let-7，它们参与线虫发育的时序调控。2001年，三个不同的研究小组同时鉴定了多个小 RNA，并且正式命名为miRNA，从而掀起miRNA研究的热潮[4-6]。研究表明miRNA主要是参与基因转录后的调控，通过与靶基因特异性结合，抑制靶基因的翻译甚至降解[7]。经过十几年的miRNA作用机理的深入研究，人们发现miRNA在疾病的发生发展过程具有重要作用，miRNA的表达失调与多种人类疾病相关，揭示miRNA可能成为疾病早期诊断和预测的生物标记，同时也是药物开发的新靶点，可能为人类疾病的治疗提供新型治疗方法[8]。

miR-223定位于X染色体，已有的研究表明与肿瘤、炎症相关的信号转导通路具有密切的联系。Chen等[9]研究发现miR-223骨髓中优势表达，Mi等[10]发现miR-223在急性髓细胞性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)患者中显著性高表达，进一步研究表明了miR-223在调节AML起着重要作用。miR-223在慢性淋巴细胞白血病(Chronic myelognous leukemia,CLL)患者中则表达下调，这些异常表达可能与肿瘤负荷及肿瘤侵袭性相关[11]。miR-223在肝癌中癌旁组织中表达量高于癌组织，而在卵巢癌中原发性低于复发性，暗示miRNA可能成为癌症的生物标记[12-13]。已经研究证实：miR-223在骨髓损伤中表达量增高，并且与炎性因子呈现正相关[14]。在类风湿关节炎患者的滑膜细胞miR-223 过度表达，从而可以抑制破骨细胞的形成[15-16]。miR-223在骨关节炎患者表达量也升高[17]，不过在活动期的系统性红斑狼疮肾炎患者是显著降低的[18]。说明miR-223 在触发炎症信号通路和在炎性、免疫性疾病的发生过程中有重要的调节作用。

目前对miR-223的具体作用机制认识还是有限的，然而研究miR-223生物学功能首先是要准确预测miR-223的靶基因和弄清楚miR-223及其靶基因的相互关系。本研究利用miRNA的进化保守性, 探讨miR-223基因家族的进化特征。采用三个在线分析软件TargetScan、PicTar和miRDB分析miR-223的靶基因，然后分析了靶基因的生物学功能，为揭示miR-223靶基因的作用机制及功能研究提供理论参考和数据支持。

1　材料与方法

1.1获取数据

从 miRBase[19](http://www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl) 中下载所有物种miR-223基因家族成员的成熟序列。

1.2序列比对与系统进化关系

利用Clustal X 1.83软件[20]对miR-223基因的成熟序列进行多序列比对，分析所有序列特征。再用MEGA 5.0软件[21]构建系统进化树，采用基于距离参数的邻接法(Neighbor-joining, NJ)，并自举检验1 000次。

1.3靶基因预测

采用在线软件TargetScan[22](http://www.targetscan.org/)、PicTar[23](http://www.pictar.org/)和miRDB[24](http://mirdb.org/miRDB/)预测人类miR-223的靶基因，最后以三者预测结果的交集作为miR-223候选的靶基因。

1.4靶基因的功能分析

运用GO: Gene Ontology[25](http://geneontology.org/)和KEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes[26](http://www.kegg.jp/)两个数据库共同分析靶基因的生物学功能，进一步认识miR-223的生物学功能。

2　结果与分析

2.1miRNA-223基因家族成员的分布特征分析

通过同源性搜索在miRBase数据中获得 miRNA-223基因家族成员的序列27条，主要分布于人类、猩猩、鼠、斑马鱼等27个物种中。miRNA-223基因家族成员在基因组中都只有一个拷贝，而且绝大部分位于基因间隔区，少数成员的基因位置未知。miRNA-223大部分定位于X染色体，部分成员位于常染色体，少数基因定位不明确(表1)。

表1　不同物种miRNA-223基因家族成员在基因组的分布特征

2.2miRNA-223基因家族序列的同源性

序列比对结果发现miRNA-223基因家族成员的序列长度是相近的，在20-23nt之间。保守碱基数为20个(除了钳鱼为8个)，说明同源性较高。miRNA的种子序列(5’端第2-8个核苷酸)在与靶基因3’UTR特异性结合后行使功能是非常重要，而且这段序列在通常是保守的，我们的比对结果证实了这一点。miRNA-223的部分位点在不同物种发生了核苷酸突变和缺失，导致miRNA-223基因家族成员间的成熟序列长度产生变化(图1)。

2.3miRNA-223基因家族成员系统进化分析

对27个物种的miRNA-223基因家族成员进行进化分析，由图2可见，系统进化树分为三支：钳鱼单独聚为一支，安乐蜥和眼镜王蛇聚为一支，人类等24个物种聚为一支。说明了人类的miRNA-223与安乐蜥、眼镜王蛇和钳鱼的分子系统进化关系较远，与其他23个物种的进化关系较近。

2.4miRNA-223靶基因预测及功能分析

利用TargetScan、PicTar和miRDB预测人类miRNA-223的靶基因分别获得562、180和242个基因(图3)，最后取三者的交集作为候选靶基因共27个(表2)。通过GO和KEGG分析获得人类miRNA-223的27个共同候选靶基因的功能注释，发现这些候选靶基因主要与信号转导、转录调控以及细胞生长发育等密切相关，表明人类miRNA-223广泛参与了生命活动的重要调控过程。另外，虽然在三个预测软件的共同靶基因中没有NLRP3，但是在TargetScan与miRDB中预测到了NLRP3 (NM_001127461)，而且Bauernfeind等[27]已经通过实验研究证实 NLRP3 (NLR family,pyrin domain containing 3) 是miR-223的靶基因，miR-223基因能够负性调节NLRP3的表达，从而影响NLRP3炎性小体的活性。

表2　3个靶基因分析软件均能预测到的miRNA-223靶基因

3　讨论

miRNA是由机体自我产生，主要通过与靶基因3’-UTR配对结合来实现对基因的转录水平或者转录后水平方式调控，调节基因的表达。miRNA参与各种生物学过程，在正常生长发育至关重要。本研究涉及的miR-223基因家族广泛存在于低等动物到高等动物，而且其成熟序列除了钳鱼外，其他所有物种的种子序列高度保守。Roberto等[28]研究发现miR-223的这种序列高度保守，暗示miR-223功能的保守性，说明miR-223基因在生物迁移和进化过程中具有重要作用。miRNA的进化机制是通过序列重复及变异进行进化，而且很可能与靶基因的进化方式相似。因此，通过鉴定及预测miRNA的靶基因，对研究miRNA的生物学功能有重要的指导作用。

本研究运用生物信息学方法,TargetScan、PicTar和miRDB三个在线分析软件预测miR-223的共同靶基因, 通过GO和KEGG分析miR-223基因家族成员的生物学功能，进一步了解miR-223可能的作用机制及其在生物体内扮演的角色。由于miRNA序列比较短，能找到的靶点假阳性比较多，因此利用多种miRNA靶基因预测软件主要是为了缩小一下实验的范围，能够减少 miRNA 靶基因寻找的盲目性, 节约实验成本。再者不同预测软件的运用预测算法不同，这3个数据库预测的结果之间存在着很大的差异，每个算法无法反映 miRNA-mRNA互作生物过程的全貌，但至少是某几方面的反映。不同的运算方法可以预测出不同的 miRNA 结合位点, 因此同时使用多种预测软件进行预测仍然十分必要。对于本文预测的靶基因正确与否，这就需要后期的生物学实验进行验证和完善。

本研究预测发现人类miR-223具有27个候选靶基因，它们主要参与了信号转导、转录调控以及细胞生长发育等多种生物学过程。Jia等[29]研究发现过量表达的miR-223能够靶向调控胰岛素样生长因子1受体的表达，影响下游PI3K/AKt和mTOR信号通路，进而抑制Hela细胞的增殖。miR-223抑制了下游靶基因F-box和WD重复包含域7(FBXW7)，影响了癌基因蛋白的泛素化降解，与癌症的发生发展相关[30]。Rodríguez-Vicent等[31]研究发现miR-223在CLL病人中表达量降低，热激蛋白90β-1(HSP90B1)表达量则增加，深入研究显示miR-223对HSP90B1负调控。Moles等[32]发现 miR-223减少了信号转导和转录激活子1(STAT1)的表达，阻断了STAT1信号在人类T细胞中转导。在巨噬细胞中miR-223通过靶定STAT3，激活 TLR 炎性通路并释放炎症因子 IL-6、IL-1β起到促炎的作用[33]。miR-223还可以抑制NLRP3炎性体的活性，研究证实NLRP3是miR-223作用靶基因，负性调节NLRP3的表达[27]，能够影响炎症反应。这些研究结果都证明了生物信息学预测结果的有效性。因此，对miR-223基因家族靶基因的预测不仅可以了解其可能参与的生物学过程，还能够为后续实验研究提供理论参考和数据支持。

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(学术编辑：刘剑平)

Molecular evolution of miR-223 gene family and prediction of their target genes

ZHONG Xiao-wu1，3,QING Yu-feng2,YANG Qi-bin2,HE Yong-long2,ZHAO Ming-cai1，3,XIE Wen-guang1,ZHOU Jing-guo2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofRheumatologyandImmunology;3.MedicineResearchCenter,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：This study aims to investigate the function of miR-223 gene family members,predict the miR-223 target gene and analyze the biological function of the miR-223 target gene.Methods：The sequence characteristic and molecular evolution of miR-223 were analyzed by Clustal X 1.83 and MEGA 5.0. TargetScan,PicTar and miRDB were used to predict target genes and the GO and KEGG were used to analyze the function annotation.Results：27 members of miR-223 gene family were obtained from miRBase database.Most of them were located in the intergenic region and a few in unknown region.A majority of miR-223 existed in X chromosome and a few in autosome.miR-223 mature sequences were from 20 to 23 nt in length and possessed high homology.Phylogenetic analysis indicated three sublines of miR-223 gene family members.27 target genes of miR-223 were predicted.And they were related with the process of signal transduction,regulation of transcription,cell growth and development and so on.Conclusion：Those results are not only of potential importance for further study on the function of miR-223 gene family members,but aslo for providing theory basis of subsequent experiment research.

miRNA-223;Molecular Evolution;Target Genes;Functional analysis

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.09

国家自然科学基金(81272047)；四川省教育厅科研项目(15ZB0197)；南充市科技支撑项目(14A0061)；川北医学院科研发展计划博士科研启动基金(CBY14-QD-07，CBY13-QD-03)

2015-07-28

钟晓武(1983-)，男，讲师。zxw_strive@163.com。通讯作者：周京国， jgzhou@nsmc.edu.cn。

时间：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.018.html

1005-3697(2016)03-0315-06

Q75；S814.8

A