MPO-ANCA相关性血管炎中抗溶酶体相关膜蛋白-2抗体的作用初探

桂雅迪，帅宗文，胡子盈，张铭明，武琳琳，陈珊宇

MPO-ANCA相关性血管炎中抗溶酶体相关膜蛋白-2抗体的作用初探

桂雅迪，帅宗文，胡子盈，张铭明，武琳琳，陈珊宇

目的 初步探讨抗溶酶体相关膜蛋白-2抗体（LAMP-2A）在髓过氧化物酶抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎（MPO-AAV）中的存在及意义。方法 采用ELISA法分别检测入选者周围血的LAMP-2A、髓过氧化物酶抗中性粒细胞胞质抗体（MPO-ANCA）、溶酶体相关膜蛋白-2（LAMP-2）、髓过氧化物酶（MPO）及活化补体C5a水平，比较LAMP-2A阳性与阴性患者间临床资料及上述指标间的差别，并分析其相关性。结果 MPO-AAV患者中LAMP-2A的阳性率为48.44%，阳性率在有无肾、肺损害患者中差异无统计学意义；病例组LAMP-2水平显著高于对照组（P＜0.001）；LAMP-2A阳性患者C5a、MPO及LAMP-2水平显著高于阴性患者（P＜0.01），并且LAMP-2A分别与C5a、MPO及LAMP-2水平呈显著正相关性（rs=0.056、0.525、0.723，P＜0.001），与MPO-ANCA及BVAS无明显相关性。结论 MPO-AAV中自身抗体LAMP-2A常见，其独立于自身抗体MPO-ANCA，可能通过促进补体旁路激活、结合升高的自身抗原（LAMP-2）等途径影响MPO-AAV的临床损害，更确切的作用和意义有待进一步探讨。

ANCA相关性血管炎；髓过氧化物酶；抗溶酶体相关膜蛋白-2抗体；溶酶体相关膜蛋白-2；补体激活；致病机制

我国AAV主要以抗髓过氧化物酶中性粒细胞胞质抗体（myeloperoxidase-antineutrophil cytoplasmic antibody，MPO-ANCA）阳性为特征的MPO-ANCA相关性血管炎（MPO-ANCA associated vasculitis，MPOAAV）为主，临床并不少见，其病情多进展迅速，常累及多系统，误诊率及病死率高［1］。目前认为MPO-ANCA是MPO-AAV的致病性抗体，但至今尚没有成功使用MPO或MPO-ANCA诱导AAV肺损害的动物模型，且有研究［2］显示，患者MPO-ANCA的水平与伯明翰血管炎活动度评分（Birmingham vasculitis activity score，BVAS）间并无肯定的相关性，推测MPO-AAV患者体内可能有其他因素参与其发病和临床损害。Kain et al［3］首先在AAV肾炎患者中发现抗溶酶体相关膜蛋白-2抗体（anti-lysosome-associatedmembraneprotein-2antibodies，LAMP-2A），阳性率超过80%，并成功建立了AAV肾脏损害的动物模型［4］。但研究［5］显示仅21%的AAV患者LAMP-2A阳性，且未发现LAMP-2A在大鼠肾小球沉积及LAMP-2A导致大鼠肾小球肾炎的发生。因此，LAMP-2A在AAV中的作用目前尚存在争议。至目前尚未见LAMP-2A在MPO-AAV中的研究报道，该研究初步探讨MPO-AAV患者中LAMP-2A的存在情况以及其与MPO-ANCA、补体旁路激活及MPO-AAV活动的关系，从更广泛的角度初步探讨MPO-AAV的临床发病和损害机制。

1 材料与方法

1.1 病例资料 选取安徽医科大学第一附属医院2012年1月～2015年3月住院AAV患者128例。首先间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）筛检每例患者p-ANCA（+），再用ELISA法定量检测MPO-ANCA水平。患者临床表现均符合美国风湿病学院GPA和EGPA的分类标准及2012年Chapel Hill共识会议（Chapel Hill Consensus Conference，CHCC）关于MPA、GPA或EGPA的分类标准［6］。为避免PR3-ANCA及ANA对研究的影响，排除PR3-ACNA（+）或ANA（+）的患者，并排除确诊为其他结缔组织病者。128例患者（病例组）中，男∶女=51∶77，年龄18～90（63.27±15.14）岁，病程2（0.5，60）个月，均为初诊未治疗的MPO-AAV患者，其中MPA 125例，GPA 2例，EGPA 1例，病情均处于活动期，BVAS 2～29（16.26±6.91）分。另于我院体检中心随机选择30例健康人作为正常对照组，男∶女=12∶18，年龄47～79（60.73±8.76）岁。收集每例患者的详细临床资料，采用BVAS评估病情活动性，采集周围静脉血并分离血清于-80℃冻存。本研究方案通过安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 ACNA及ANA检测 以酒精固定的人中性粒细胞和Hep-2细胞为底物（欧蒙医学实验诊断股份有限公司试剂盒），IIF法检分别筛检外周血ANCA和ANA，筛选仅p-ANCA阳性的患者，剔除c-ANCA或ANA阳性者。

1.2.2 MPO-ANCA检测 采用ELISA方法定量检测患者血清MPO-ACNA水平。96孔酶标板中每孔包被人MPO抗原（美国Sigma公司）2 μg，1∶100稀释的患者或正常对照血清为一抗，抗碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）标记的羊抗人IgG（美国Sigma公司）经1∶5 000稀释为二抗，其余实验步骤同常规ELISA。取正常对照组吸光度（absorbance，A）值的+2s为正常值上限，高于正常值上限为阳性，除外ELISA检测MPO-ANCA阴性患者。

1.2.3 LAMP-2A、LAMP-2、C5a、MPO检测 采用ELISA方法（美国TSZ公司试剂盒），按照各试剂盒说明书操作步骤检测患者及正常对照组外周血LAMP-2A、LAMP-2、C5a、MPO水平。LAMP-2A的检测和结果判定方法同MPO-ANCA，取正常对照组所测指标A值的+2s为正常值上限，高于正常上限值为阳性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料用±s表示，2组样本间比较采用经Welch校正的非配对t检验。计数资料用四分位数表示，2组样本间比较采用χ2及秩和检验分析。相关分析采用Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 病例组血清LAMP-2A的阳性率及LAMP-2水平变化 病例组与健康对照组间性别构成（χ2= 0.000，P=0.987）及年龄比较（t=1.218，P= 0.227）差异无统计学意义。以健康对照组LAMP-2A的ELISA检测A值的+2s为正常值上限，检测病例组LAMP-2A的阳性率为48.44%（62/128）。128例患者中70.31%（90/128）合并有肾损害，67.19%（86/128）合并有肺损害，有、无肺/肾损害患者间LAMP-2A阳性率比较见表1，结果显示差异无统计学意义。病例组血清LAMP-2水平显著高于正常对照组，差异有统计学意义［0.142（0.102，0.238）vs 0.082（0.063，0.106），Z=-5.112，P＜0.001］。

表1 有、无肾/肺损害患者中LAMP-2A的阳性率比较（n）

2.2 LAMP-2A阳性与阴性患者间部分临床指标的比较 将62例LAMP-2A阳性与66例阴性患者各设为一组，比较2组间部分临床指标，显示两组间性别构成、年龄、病程、BVAS及MPO-ANCA水平比较差异无统计学意义，但2组间血清C5a、MPO及LAMP-2水平比较差异有统计学意义，LAMP-2A阳性组显著高于阴性组，见表2。

2.3 LAMP-2A与部分临床指标的相关性分析

将62例LAMP-2A阳性患者的LAMP-2A水平分别与MPO-ANCA、MPO、C5a及LAMP-2及BVAS作相关分析，显示LAMP-2A分别与MPO、C5a及LAMP-2呈显著正相关性（rs=0.525、0.056、0.723，P＜0.001）。与MPO-ANCA及BVAS无明显相关性（rs=-0.209，P=0.285；rs=-0.081，P=0.530）。

表2 LAMP-2A阳性与阴性患者间临床资料及观察指标的比较

3 讨论

Kain et al［3］最早在AAV患者中发现抗LAMP-2抗体的阳性率是87%。随后的两次研究中，该抗体的阳性率均在80%以上［4，7］。然而，Roth et al［5］在AAV患者中测得该抗体的阳性率仅为21%。本研究显示MPO-AAV患者中LAMP-2A的阳性率为48.44%，除种族差异外，分析此阳性率的差异可能与AAV疾病的构成及治疗的影响有关。本研究选择的病例符合中国AAV以MPO-ANCA阳性MPOAAV为主的特点，为除外治疗对观察指标的可能影响，入选病例均为未经治疗的初诊病例，而Kain et al［3-4，7］选择的病例包括MPO-AAV和PR3-AAV，均为经病理证实的ANCA相关性寡免疫复合物型局灶性坏死性肾小球肾炎（pauci-immune focal necrotizing glomerulonephritis，FNGN），且病情处于活动期，部分患者经免疫抑制剂治疗病情缓解后LAMP-2A消失，认为该抗体与疾病活动度相关。Roth et al［5］选择的AAV病例也经病理证实为寡免疫肾小球肾炎，但44.12%的入选病例病情处于缓解期（BVAS=0），结果未显示该抗体与AAV病情活动性之间存在显著相关性。上述研究均以探索寡免疫肾小球肾炎发病机制为目的，选择的患者均强调其有肾脏损害，而AAV中肾和肺均为最常见的损害器官［1］，本研究比较并发肾、肺损害患者LAMP-2A的阳性率，显示差异无统计学意义，提示在AAV中，LAMP-2A并非特异存在于肾损害的患者。

近年来，动物实验［8］与临床研究［9-10］显示补体旁路途径激活在AAV中发挥重要作用，阻断补体旁路途径激活的C5a可以阻止AAV的发病［11-12］，前期研究［13］也显示MPO-AAV患者周围血中C5a水平明显升高，而升高的C5a水平可趋化中性粒细胞，与中性粒细胞C5a受体结合，活化并促进中性粒细胞活性，加重炎症反应［14］。LAMP-2A如何介导AAV的临床损害，目前仍不清楚，本研究显示，LAMP-A阳性患者C5a水平明显高于阴性患者，且二者水平呈显著正相关性，推测该抗体可能通过某种间接途径，参与补体旁路途径的激活，因为补体旁路途径的激活，特异性抗体（除IgG4外）并非直接激活补体的主要途径。

Kain et al［4］发现人LAMP-2蛋白与具有一型纤毛细胞的革兰阴性菌的黏附素FimH有高度同源性，研究［4］表明69%LAMP-2A阳性FNGN患者患病之前12周内有FimH细菌感染史，从而认为感染菌的FimH与LAMP-2间的分子模拟是LAMP-2A产生的机制之一，但并非所有LAMP-2A阳性患者均感染FimH菌。本研究结果显示，比较LAMP-2水平，MPO-AAV患者显著高于健康对照者，LAMP-2A阳性患者LAMP-2、MPO水平明显高于阴性患者，且LAMP-2A分别与LAMP-2及MPO呈显著正相关性，据此推测，MPO-ANCA通过诱导中性粒细胞脱颗粒及炎症破坏，可能增加血MPO及LAMP-2水平，其中，血循环中自身抗原LAMP-2的升高，一方面有利于其自身抗体LAMP-2A的形成，另一方面促进抗原抗体结合相关的免疫炎症反应。

本研究显示有48.44%的MPO-AAV患者中存在LAMP-2A，但两种自身抗体MPO-ANCA与LAMP-2之间并无明显的相关性，Kain et al［3］及Peschel et al［15］也发现，部分ANCA阴性的AAV患者体内存在LAMP-2A，显示MPO-ANCA与LAMP-2A二种自身抗体间彼此的独立性。本研究结果显示LAMP-2A阳性与阴性患者间性别构成、病程并无差别，提示LAMP-2A的出现并非由于性别差异或慢性病程导致。LAMP-2A阳性与阴性患者间BVAS差异无统计学意义，且LAMP-2A水平与BVAS间也并无相关性，推测影响MPO-AAV患者病情活动性应该是多因素的，除LAMP-2A外，其他因素尚应包括MPO-ANCA、补体旁路途径等。

［1］ 吕远帆，帅宗文，张铭明，等.髓过氧化物酶-抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎132例临床分析［J］.中华风湿病学杂志，2014，18（5）：308-12.

［2］ Mahler M，Radice A，Yang W，et al.Development and performance evaluation of novel chemiluminescence assays for detection of anti-PR3 and anti-MPO antibodies［J］.Clin Chim Acta，2012，413（7-8）：719-26.

［3］ Kain R，Matsui K，Exner M，et al.A novel class of autoantigens of anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in necrotizing and crescentic glomerulonephritis：the lysosomal membrane glycoprotein hlamp-2 in neutrophil granulocytes and arelated membrane protein in glomerular endothelial cells［J］.J Exp Med，1995，181（2）：585-97.

［4］ Kain R，Exner M，Brandes R，et al.Molecular mimicry in pauciimmune focal necrotizing glomerulonephritis［J］.Nat Med，2008，14（10）：1088-96.

［5］ Roth A J，Brown M C，Smith R N，et al.Anti-LAMP-2 antibodies are notprevalent in patients with antineutrophil cytoplasmic au-toantibody glomerulonephritis［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23（3）：545-55.

［6］ Jennette J C，Falk R J，Bacon P A，et al.2012 revised international chapel hill consensus conference nomenclature of vasculitides［J］.Arthritis Rheum，2013，65（1）：1-11.

［7］ Kain R，Tadema H，McKinney E F，et al.High prevalence of autoantibodies to hLAMP-2 in anti-neutrophil cytoplasmic antibodyassociated vasculitis［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23（3）：556-66.

［8］ Xiao H，Schreiber A，Heeringa P，et al.Alternative complement pathway inthe pathogenesis of disease mediated by anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies［J］.Am J Pathol，2007，170（1）：52-64.

［9］ Xing G Q，Chen M，Liu G，et al.Complement activation is involved in renal damage in human antineutrophil cytoplasmic autoantibody associated pauci-immune vasculitis［J］.J Clin Immunol，2009，29（3）：282-91.

［10］Gou S J，Yuan J，Chen M，et al.Circulating complement activation in patients with anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis［J］.Kidney Int，2013，83（1）：129-37.

［11］Huugen D，van Esch A，Xiao H，et al.Inhibition of complement factor C5 protects against anti-myeloperoxidase antibody-mediated glomerulonephritis in mice［J］.Kidney Int，2007，71（7）：646-54.

［12］Xiao H，Dairaghi D J，Powers J P，et al.C5a receptor（CD88）blockade protects against MPO-ANCA GN［J］.J Am Soc Nephrol，2014，25（2）：225-31.

［13］武琳琳，帅宗文，胡子盈，等.髓过氧化物酶-抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎活动期血清标志物的研究［J］.医学研究生学报，2015，28（4）：406-10.

［14］Hao J，Chen M，Zhao M H.Involvement of protein kinase C in C5a-primed neutrophils for ANCA-mediated activation［J］.Mol Immunol，2013，54（1）：68-73.

［15］Peschel A，Basu N，Benharkou A，et al.Autoantibodies to hLAMP-2 in ANCA-negative pauci-immune focal necrotizing GN［J］.J Am Soc Nephrol，2014，25（3）：455-63.

Investigation on the role of anti-lysosome-associated membrane protein-2 antibody in MPO-ANCA associated vasculitis

Gui Yadi，Shuai Zongwen，Hu Ziying，et al
（Dept of Rheumatology and Immunology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To preliminarily investigate the prevalence and role of anti-lysosome-associated membrane protein-2 antibody（LAMP-2A）in myeloperoxidase-antineutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis（MPOAAV）.Methods The peripheral blood from all patients was taken to detect LAMP-2A，myeloperoxidase-antineutrophil cytoplasmic antibody（MPO-ANCA），lysosome-associated membrane protein-2（LAMP-2），myeloperoxidase（MPO）and activated complement C5a by ELISA.These test results and some of other clinical indices were comparatively analyzed between LAMP-2A positive and negative group，and the relationships between LAMP-2A and either of these induces were also investigated.Results The positive rate of LAMP-2A was 48.44%in MPO-AAV patients.This positive rate showed no significant difference between patients with nephric/pulmonary damage and without nephric/pulmonary involvement.The LAMP-2 level in patient group was higher than that in control group（P＜0.001）.The levels of C5a，MPO and LAMP-2 in patients with positive LAMP-2A were significantly higher than that in patients without LAMP-2A（P＜0.01）.Moreover，LAMP-2A had markedly positive correlations with either of C5a，MPO and LAMP-2（rs=0.056，0.525，0.723；P＜0.001，respectively）while there was no obvious relationship between LAMP-2A and MPO-ANCA or BVAS.Conclusion LAMP-2A is a common autoantibody in MPOAAV and is independent from the other autoantibody MPO-ANCA.It might play an important role in the pathogenesis of clinical lesions in MPO-AAV by some way like promoting the activation of alternative complement pathway，combining with its elevated autoantigen LAMP-2 and so on.Further investigations on the exact roles of LAMP-2A in MPO-AAV are necessary.

antineutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis；myeloperoxidase；anti-lysosome-associated membrane protein-2 antibody；lysosome-associated membrane protein-2；complement activation；pathogenic mechanism

R 593.27

A

1000-1492（2016）08-1196-04

时间：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.056.html

2016-05-04 接收

中华医学会临床医学科研专项资金项目（编号：08010290107）

安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科，合肥 230022作者简介：桂雅迪，女，硕士研究生；

帅宗文，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：shuaizongwen@medmail.com.cn