L-丝氨酸检测技术的研究进展

李忠财， 董会娜， 张大伟*， 丛丽娜

1.大连工业大学生物工程学院，大连 116034

2.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308



L-丝氨酸检测技术的研究进展

李忠财1,2， 董会娜2， 张大伟2*， 丛丽娜1*

1.大连工业大学生物工程学院，大连 116034

2.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308

L-丝氨酸作为一种非必需氨基酸，它在药物、化工产品以及食品等方面得到了广泛应用，是一种重要的工业产物，具有很重要的研究价值。快速、准确、高通量的检测L-丝氨酸含量的方法，能够为高通量菌种选育提供坚实的基础。本文介绍了目前检测L-丝氨酸含量的多种方法，包括变色酸-分光光度法、纸层析-分光光度法、荧光猝灭法、茚三酮显色法、高效液相色谱法、酶反应检测法及毛细管电泳-电致化学发光(CE-ECL)法，同时通过比较它们的优缺点，并针对L-丝氨酸检测中存在的各种问题进行讨论分析，对L-丝氨酸的检测技术进行展望。

L-丝氨酸； 检测技术； 氨基酸

L-丝氨酸属于一种非必需氨基酸，它是参与合成胞内生物物质嘌呤、嘧啶、磷脂等的重要前体[1-3]。在医药方面L-丝氨酸广泛应用于氨基酸输液和营养添加剂，它的衍生剂也具有优良的药用和生物活性[4]。此外，因L-丝氨酸具有特殊的润湿性和保湿性，在国内外被大量用于高级化妆品中[5]。随着对L-丝氨酸研究的深入认识和医药保健事业的不断发展，人们对L-丝氨酸的需求量正迅速扩大。因此一种快速简便测定混合氨基酸中L-丝氨酸的含量的检测方法对L-丝氨酸的开发利用具有重要意义。

近些年，随着分析仪器的更新换代以及对丝氨酸的深入研究，使得丝氨酸分析检测方法的准确度和精密度都有了大幅度的提高。目前检测丝氨酸的方法主要有：变色酸-分光光度法、纸层析-分光光度法、荧光猝灭法、茚三酮显色法、高效液相色谱法以及酶反应检测法等。

1 变色酸-分光光度法

变色酸-分光光度法的原理是在一定的pH条件下，丝氨酸碳链末端的-OH能被高碘酸钠氧化成醛，这种醛又能与变色酸发生反应，呈现紫色，在570 nm处有最大吸收值[6, 7]，如图1。该方法操作方便、所用仪器较简单、成本较低、显色灵敏、检出限低，且在复杂的氨基酸混合物中检测丝氨酸不会受到干扰。但该方法中的吸光度易受到如加热时间、显色剂用量和有色化合物稳定性等方面的影响，从而影响检测丝氨酸的准确性。周圆圆等[8]研究了变色酸法分光光度法检测丝氨酸的分析方法，最终确定在变色酸2.0 mL，波长位于570 nm处，经过30 min的沸水浴显色，能够得到最好的显色效果。同时通过样品回收率实验验证表明：变色酸-分光光度法回收率均在100%左右，平均回收率为100.30%，相对标准偏差(RSD)为1.11%，进一步表明该方法极少受到样品中其他混合氨基酸的干扰，具有很好的重复性和准确性。

图1 丝氨酸与变色酸的显色反应

变色酸-分光光度法方法使得丝氨酸的检测操作方便，所用仪器较简单、成本较低、显色灵敏稳定，检出限低，易于掌握且在复杂的氨基酸混合物中, 没有受到干扰可提高测量结果准确度的优点，故可应用于准确测定混合氨基酸中丝氨酸含量。但是，丝氨酸与变色酸反应结束后在10 min内是比较稳定的，因此我们需要注意反应产物应当尽快测量。

2 纸层析-分光光度法

纸层析法是分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于多种氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。其原理是用滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上吸附的水或其它在层析过程中不流动的溶剂是固定相，展层用的有机溶剂是流动相。在层析时，样品随流动相沿滤纸的一个方向进行展层，由于不同氨基酸在两相溶剂中的分配系数(Kd)不同，不同组分会以不同的速度移动，从而使得它们分布在滤纸的不同位置上，最终达到分离[9]。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值Rf(rate of flow，样品起始点至氨基酸停留点中心的距离与起始点至溶剂前沿的距离的比值)来表示。根据各种氨基酸的Rf不同以及它们与显色剂显色后颜色的差别，达到对氨基酸进行定性鉴定和定量测定[10]。纸层析-分光光度法具有准确度高、重复性好、操作简单、易于掌握等特点。王薇等[11]经重复性、干扰以及稳定性实验验证表明，该方法平均回收率为100.48%，RSD为1.74%，进一步表明该方法具有很好的重复性和准确性。但是，此方法的不足之处是反应产物如放置长时间(超过10 min)后，测定丝氨酸质量浓度的RSD会显著增加，测定结果与实际结果偏离较大[11, 12]。

用纸层析-分光光度法测定L-丝氨酸含量具有较高的准确度和精密度。线性相关显著，而且操作方便、易于掌握，所用仪器较简单，具有一次性处理量大(通量高)的优点，在L-丝氨酸产生菌筛选和条件优化中非常适用。

3 荧光猝灭法

荧光猝灭法检测丝氨酸是通过磷酰化丝氨酸水解产生无机磷酸盐猝灭铽离子-钛铁试剂络合物(Tb3+-TR)荧光探针的间接荧光法测定磷酰化丝氨酸的一种方法[13]。该方法利用铽离子-钛铁试剂络合物(Tb3+-TR)荧光探针监测了磷酰化丝氨酸(P-Ser)、磷酰化苏氨酸(P-Thr)和磷酰化酪氨酸(P-Tyr)在一定条件下的完全水解，并通过磷酰化氨基酸水解产生的无机磷酸盐猝灭Tb-TR络合物荧光探针的荧光可间接测定磷酰化丝氨基酸(P-丝氨酸)。因此可采取预先水解磷酰化氨基酸，通过测定水解产生的磷酸盐间接测定磷酰化丝氨基酸的含量。这种方法多用于蛋白质中氨基酸的测定。由于在真核生物细胞蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化是最常见的磷酰化类型[14-16]，所以可以用荧光猝灭法来检测磷酰化氨基酸从而可以证实很多蛋白的重要作用[13]。随着科学技术的不断发展，许多因素的加入及简化使得荧光猝灭法不断优化。

4 茚三酮显色法

茚三酮显色法原理是在弱酸性条件下，α-氨基酸与茚三酮中共热，反应后生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色或蓝色物质，如图2。丝氨酸与茚三酮在弱酸条件下反应会生成紫红色物质[17, 18]，此反应十分灵敏，根据反应生成物质颜色的深浅，在570 nm下进行比色就可以测定样品中丝氨酸的含量[19]。这种显色反应产物主要是通过缩合反应形成，与羰基化合物和氨的衍生物之间的反应类似[20]，反应中pH，温度，反应时间以及显色剂用量的改变均会使产物颜色不稳定，对准确测定氨基酸含量的结果造成一定的影响。有研究表明：利用茚三酮比色法定性定量检测丝氨酸的最佳实验条件为溶液pH在4.5左右，显色剂用量为每10 mL展层剂中加入2.5 mL 0.1%的茚三酮，并在105 ℃下干燥加热5 min[30]。所以丝氨酸所处的环境不同，测定条件也会发生改变。

近些年茚三酮法与层析法的结合，提高了层析分离的效果，使图谱显色均匀，色斑清晰。不仅省略了显色液及喉头喷雾器，节省了仪器设备，简化了操作步骤，而且还节约了时间，使操作更简便、易行，同时也将显色剂茚三酮的浓度降为0.1%，节省了试剂[21]。

图2 α-氨基酸与茚三酮的显色反应

5 高效液相色谱法

高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph，HPLC)是目前氨基酸分析领域应用最广、发展最快的现代分析技术之一，它是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱法的理论和技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器发展而成的现代液相色谱分析方法，具有分离分析速度快，灵敏度高、选择性好，可分析微量组成样品等特点[22]。利用HPLC方法分析氨基酸的过程主要是：首先，将氨基酸转化为具有荧光的氨基酸衍生物；其次，将传统的茚三酮反应用荧光监测器代替来鉴定氨基酸。这样不仅可以进一步缩短分析时间，显著性提高灵敏度，而且能够更好地发挥高效液相色谱地特点。

目前已报道的柱前衍生试剂很多，常用的含有邻苯二甲醛、丹酰氯、氯甲酸芴甲酯、异硫氰酸苯酯等。随着研究工作的深入，柱前衍生结合 HPLC 法已成为氨基酸分离和分析的重要手段[23,24]。

在HPLC方法当中流动相的选择，流动相pH的选择以及衍生时间的控制都非常重要。如果流动相pH太低，保留时间较长，峰面积会减小，灵敏度会降低；反之，随pH的增大，保留时间缩短，峰面积增大。同时衍生时间也可以很大程度上影响对氨基酸的峰面积，如果衍生时间太短，反应不完全，浓度与峰面积的线性不好；反之，衍生时间太长，氨基酸与衍生剂形成的化合物极易降解，也会导致上述问题。因此根据具体的测量物质要进行适当的更改。

6 酶反应检测

目前对利用酶法检测丝氨酸的报道还不是很多。Toyokazu[25]等研究了在甲基营养生物中L-丝氨酸和乙醛酸的酶促反应检测方法。主要由两步反应组成，第一步反应是L-丝氨酸和乙醛酸盐在丝氨酸氨基转移酶(SGAT)作用下反应生成羟基丙酮酸和甘氨酸，第二步反应是羟基丙酮酸与NADH在羟基丙酮酸还原酶催化下反应，最后通过检测NADH的下降量间接的来确定L-丝氨酸的含量，如图4。Roger D. Hurst等研究了通过把L-丝氨酸在PBST、L-磷酸丝氨酸转氨酶和D-3-磷酸脱氢酶的作用下转换成L-磷酸丝氨酸，用分光光度法或者荧光光度法检测L-丝氨酸[26]。酶反应方法对于检测L-丝氨酸的优点是快速，专属性好，精确性好。

L-serine+glyoxylate→hydroxypuyuvate+glycine

hydroxypyruvate+NADH→D-glycerate+NAD+

图3 L-丝氨酸和乙醛酸的酶反应原理

7 毛细管电泳-电致化学发光法

毛细管电泳(CE)是将毛细管看为分离的通道，以高压的直流电场作为驱动力的一种新型分离及分析的技术，使分析化学这门学科得以从微升的水平发展到纳升的水平，并使单细胞，乃至单分子的研究成为很大的可能。毛细管电泳具有检出限低，进样量少等优点[27-29]，由于内径狭窄也给检测带来了困难。因此，为了提高灵敏度，很多学者在不断研究的过程中开辟了新领域。将电致化学发光( ECL) 检测方法与 CE 技术联用，可形成一种同时具备高效分离与高灵敏检测的新方法[30-31]。ECL 检测是在化学发光和电化学基础上发展起来的一种新的分析技术。ECL不但保留了化学发光分析和电化学分析固有的优点，同时还具有其自身的优点，如所发生的化学发光反应易于控制、方法更灵敏、扩大了化学发光方法可检测的范围，更易于与现代分离技术联用。

李靖等[32]在化学修饰电极研究的基础上，将毛细管电泳-电致化学发光(CE-ECL)与化学修饰电结合，对L-丝氨酸进行分离检测，并优化了影响电致化学发光的各种因素如检测电位，不同的发光试剂，缓冲溶液 pH，检测电压等。证明该方法具有操作简便、所需试剂量少、检测快速等特点。

8 小结

目前，国内外用于L-丝氨酸检测的方法主要包括高效液相色谱法、茚三酮法、荧光淬灭法，酶反应法、纸层析-分光光度法等。其中高效液相色谱法其灵敏度好，准确度高，常用于L-丝氨酸的定量测定。茚三酮显色法作为最基本最传统的检测方法，其操作简便、反应快速，但是其对反应条件的要求较高，需要对反应温度、pH、时间进行精确控制，并且对不同种类的氨基酸具有不同的灵敏度，不适合分析对精确性要求较高的样品。荧光猝灭法可以避免大部分氨基酸的干扰，但是样品需要经过复杂的磷酰化预处理，并且检测结果误差较大。酶反应法具有良好的专属性和精准性，但是其反应速度过慢，反应体系中所用酶的纯化步骤复杂，储存条件限制多。纸层析-分光光度法操作简便，适用于菌株筛选中氨基酸的定性检测，但是其稳定性差，不适用大批量样品的分析检测。变色酸-分光光度法反应速度快，操作简单，准确度高。准确、快速、高通量的检测方法均可用于大量样品的发酵液中L-丝氨酸的定量检测。

近年来，对L-丝氨酸检测分析的方法不断发展，但是应用最为广泛的仍然是高效液相法，这种技术可以精确定量L-丝氨酸含量，是目前L-丝氨酸定量检测应用最广泛的方法。一些快速简便的L-丝氨酸检测方法不断出现或改良，如纸层析-分光光度法、变色酸-分光光度法等，虽然这些检测方法的快速性得到很大提升但是精确性仍然不尽如人意。随着社会和科学的发展，对于快速、准确、高通量的L-丝氨酸检测方法需求越来越多，检测设备的更新以及科学家对L-丝氨酸更全面深入的研究会使L-丝氨酸检测方法在快速、准确、高通量方面有大幅度的提高。

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LI Zhong-cai1,2, DONG Hui-na2, ZHANG Da-wei2, CONG Li-na1

1. School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China 2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin 300308,China

Development of analytical methods for L-serine

L-serine, as one of the nonessential amino acids， is an important industrial product with research value, widely used in medicine, chemical products and foods. As fast, accurate and high-throughput method for detecting L-serine concentration could lay the foundation for high-throughput screening of L-serine producing strains, various kinds of methods for detecting the concentration of L-serine were mainly introduced, including chromotropic acidspectrophotometry, paper chromatogram physpectrophotometer, fluorescence quenching method, ninhydrin coloration method, high-performance liquid chromatography, enzymatic assays method and CE-ECL. Moreover, the advantages and disadvantages of these methods were compared and discussed. And the development of analytical methods for L-serine was forecasted.

L-serine; analytical methods; amino acid

国家自然基金(31370089)，天津市科技支撑计划重点项目(14ZCZDSY00065)，天津市自然科学基金(16JCYBJC23500，15JCQNJC09500)。

李忠财(1989～)，男，硕士研究生。E-mail:li_zhc@tib.cas.cn。

*通讯作者: 丛丽娜(1962～)，女，教授。E-mail:linacong@163.com；张大伟(1978～)，男，研究员。E-mail:zhang_dw@tib.cas.cn。