保护剂对重组大肠杆菌NMN转移酶稳定性的影响

段琳琳， 李红梅

上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 杨浦 200093



保护剂对重组大肠杆菌NMN转移酶稳定性的影响

段琳琳， 李红梅*

上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 杨浦 200093

通过向NMN转移酶(Nmnat)中添加保护剂以提高其热稳定性及储存稳定性，扩大酶的使用范围。研究了固体醇类(山梨醇、甘露醇)、糖类(海藻酸钠、蔗糖、甘露糖)和有机溶剂(DMSO、丙二醇-单甲醚、乙醇、甘油)对Nmnat的稳定性的作用，通过正交实验得到一种复合保护剂，并研究复合保护剂对Nmnat最适反应温度、pH稳定性、储存稳定性的影响。结果表明，山梨醇、海藻酸钠和DMSO能够显著提高Nmnat的热稳定性。复合保护剂配方为山梨醇1.5 g/L，海藻酸钠1.0 g/L，DMSO 0.5%。复合保护剂的添加使Nmnat的最适反应温度从37 ℃提高到50 ℃；50 ℃保温2 h酶活提高了24.5%；pH使用范围由7.0～8.0扩大到6.0～8.0；4 ℃储存28 d后，酶活保留率提高了15.65%。

NMN转移酶； 保护剂； 热稳定性； 正交实验

NMN转移酶(Nmnat)是一类在蛋白折叠过程中与ATP相耦联，利用NMN生成NAD和NAAD，维持体内NAD的平衡的酶类，也是一种指示蛋白和应激反应蛋白，可作为生物药剂的靶标和调控目的基因的转录合成，在生物体生命活动中起着十分重要的作用[1-3]。大量研究表明，Nmnat在自然界中来源极为广泛，主要是植物、动物以及微生物。如此丰富的资源，以及人类对Nmnat研究的不断深入，使得Nmnat在医药、生物、工业生产等领域得到了广泛应用[4]。

Nmnat作为一种同源性蛋白，在生产、加工和贮存过程，由于外界因素，如温度、有机溶剂、pH和金属离子等影响，易导致酶稳定性降低，甚至失活[5]。Medicina和Ranieri等研究发现来源于人类胎盘组织的Nmnat在37 ℃保温30 min后，酶活下降约70%[6]; 来源于大肠杆菌的Nmnat在60 ℃时半衰期也仅有2.5 min[7]。因此，提高Nmnat的热稳定性、减少失活率和延长贮存期是当前研究重点。目前提高酶稳定性的方法主要有筛选耐热菌株、固定化、化学修饰和添加保护剂等。其中添加保护剂法操作简单、成本较低，成为提高酶稳定性的最有效最直接的手段，其研究也日益增多[8]。如刘彩琴等发现加入10%的甘油可以使α-半乳糖苷酶的酶活保留率由52.48%提高到78.44%[9]；Costa S A等通过研究不同添加物质对过氧化氢酶稳定性的影响，发现加入聚乙二醇可以使过氧化氢酶在60 ℃保存10 min后，酶活保留率高达64.5%，相比对照组23.5%提高了41%[10]。

本课题通过基因工程手段已成功构建产Nmnat的重组大肠杆菌，并对Nmnat的酶学性质进行了系统分析，发现该酶热稳定性差、耐酸碱能力低且储存时间短[7]。鉴于添加保护剂对改善酶热稳定性具有积极作用，本研究通过添加不同保护剂，考察其对Nmnat稳定性的影响，寻找提高酶稳定性的新方法提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 山梨醇、甘露醇、乙醇、甘油、海藻酸钠、蔗糖、甘露糖、DMSO、丙二醇-单甲醚和硼酸均为分析纯。

1.1.2 Nmnat酶液 由本实验室发酵纯化制得。

1.1.3 试验仪器 离心机、冷冻冰箱、恒温水浴锅。

1.2 方法

1.2.1 酶活力的测定方法

反应体系:1 mol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲液，300 mmol/L NMN，50 mmol/L ATP，50 mmol/L Mn2+，乙醇2%，0.955 g/mL酶液，7U的ADH(乙醇脱氢酶)混匀。所有液体都用ddH2O配制。然后置于37 ℃的恒温水浴锅中振荡反应2 h，加入0.155 mol/L的EDTA反应5 min，终止酶反应，反应液冰浴冷却8 000 r/min离心1 min，取上清液并在340 nm处测定反应产物的吸光值OD340，代表Nmnat酶活力大小。酶活定义为：在37 ℃，1 mL反应体系中，每分钟催化得到1 μmol NMN的酶量为1 U，比酶活用U/mg或U/g表示。

1.2.2 不同浓度的保护剂配制

山梨醇、甘露醇、乙醇和甘油浓度分别为0.0%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%；海藻酸钠、蔗糖和甘露糖浓度分别为0.0 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L和2.0 g/L；DMSO、丙二醇-单甲醚和硼酸浓度分别为0.0%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%。

1.2.3 不同浓度的保护剂对酶活的影响

将不同类型的保护剂和酶液按照一定的比例混合，于37℃下按照酶活的测定方法测定酶活力大小，以不加任何添加物的酶活为相对酶活，其计算公式如下：Ar=(Ap-A0)/A0

其中：Ar为相对酶活%，AP为加入保护剂的酶活，A0为未加入保护剂的酶活。

1.2.4 复合保护剂的配比

选出3种效果较好的单一保护剂，进行正交复配实验，以1.0 g/L(1.0%)为中间水平，设计3因素3水平的正交配比实验，结果如表1所示，每个实验重复3次，结果为其平均值。

1.2.5 复合保护剂对Nmnat最适反应温度的影响

将不同类型的保护剂和酶液按照一定的比例混合，在不同温度(20 ℃、30 ℃、37 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃)下，测定酶活力，以未处理的酶液的酶活为100%。

1.2.6 不同温度下复合保护剂对Nmnat热稳定性的影响

将正交实验测得的最佳保护剂(复合保护剂)按照一定的比例加入到酶液中(处理组)和未加入保护剂的酶液(对照组)分别置于不同的温度下(20 ℃、30 ℃、37 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃)水浴保温1 h和2 h，立即冰浴冷却，测定其酶活力，以未经任何处理的酶液的酶活为对照，计算其酶活的保留率(%)。

1.2.7 复合保护剂对Nmnat pH稳定性的影响

配制1 mol/L醋酸-醋酸钠pH 4.0～6.0的缓冲液，1 mol/L的磷酸盐pH 6.0～7.0的缓冲液，1 mol/L Tris-HCl pH 7.5～9.0的缓冲液，将酶液放置在不同的pH中4 ℃放置24 h，测定Nmnat和加入复合保护剂的Nmnat的酶活，检测pH对酶促反应的影响。

图7为在相同的运动加速度情况下,应用本文提出的基于加速度分离算法的改进卡尔曼滤波进行姿态解算的姿态误差曲线。

1.2.8 低温条件下保护剂对Nmnat储存稳定性的影响

研究4 ℃条件下，加入复合保护剂的酶液(处理组)和未加入保护剂的酶液(对照组)，在不同的保存时间(0 d、7 d、14 d、21 d和28 d)内，测定酶活的保留率，以0 d时的最初酶活力为100%。

2 结果与分析

2.1 单一保护剂对Nmnat稳定性的影响

2.1.1 固体醇类保护剂对Nmnat稳定性的影响

醇类属于羟基化合物，其羟基可以和酶的酰胺基形成氢键，有研究表明酰胺键的形成能加强酶分子热稳定性，提高酶的活力；此外多元醇类还可以与水分子相互作用，改变水的表面张力，减少介质的介电常数，加强酶分子的疏水作用，使酶液体系更加均一，蛋白质结构更稳定[11]。因此，本研究采用山梨醇、甘露醇作为保护剂，考察其对Nmnat稳定性的影响。

结果如图1所示，固体醇对Nmnat的稳定作用随着浓度的增大呈现先上升后下降的趋势，其中，山梨醇对Nmnat稳定作用效果较好，当浓度为1.0%时，相对酶活力达到了73.68%，相比对照组提高了65.78%。归结其原因可能是山梨醇的多羟基和酶分子发生作用，减少了酶分子的水合作用，从而加强酶分子的稳定性。Back等研究也发现多羟基物质中山梨醇对多种蛋白质都有着比较好的保护作用[12]。甘露醇的保护效果较弱，最适浓度下相对酶活为53.46%，且当甘露醇浓度大于2.0%时，相对酶活反而低于对照组，可是其溶解吸热和吸湿性造成酶结构的不稳定性。

图1 固体醇类保护剂对Nmnat 稳定性的影响

2.1.2 糖类保护剂对Nmnat稳定性的影响

众多研究表明糖类的多羟基会与酶的水溶液相互作用，使酶与水之间溶剂化，且其氢键能够改变酶分子折叠的驱动力，降低酶分子的自由能，增强酶分子的稳定性[13]，因此糖类被认为是保护酶热稳定性的一种有效保护剂。

本实验选择海藻酸钠，蔗糖以及甘露糖三种糖类进行研究，其结果如图2所示。三种糖对Nmant稳定性均呈现先升高后降低的趋势，其原因可能归功于低浓度的糖更容易与水分子相互作用，稳定酶分子结构，而高浓度的糖将增加溶液渗透压，改变酶分子构象从而导致酶活降低。从图2中可以看出，海藻酸钠的保护作用最强，当浓度为1.0 g/L时，相对酶活较对照组提高了65.45%；蔗糖和甘露糖在最适宜的浓度1.5 g/L时，相对酶活分别较对照组提高50.12%和41.38%。对此可能的解释是在二糖中海藻糖含有的羟基数目最多，与水分子形成氢键可以降低蛋白质的自由能，使蛋白质结构更稳定。

图2 糖类保护剂对Nmnat稳定性的影响

2.1.3 有机溶剂对Nmnat稳定性的影响

Griebenow提出适当浓度的有机溶剂可以减少蛋白质表面的水化膜，降低水分子的活度，增加溶液的粘稠性，从而降低水合作用对酶分子结构的影响，起到保护酶稳定性的作用，但浓度增大时，维持酶的活性构象变化所需的柔性减小，反而导致酶分子抵抗失活的能力减弱[14]。

本实验考察了DMSO、丙二醇-单甲醚、乙醇和甘油对Nmnat酶活的影响，结果如图3所示。随着浓度的增大，三种有机溶剂对Nmnat的影响呈现先上升后下降的趋势，与Griebenow研究结果相符合。其中，DMSO对酶活的稳定作用较大，当浓度为1.0%时，相对酶活提高了70.02%，而丙二醇-单甲醚、乙醇和甘油相对酶活较对照组仅提高了39.31%、45.34%和43.18%。四种有机溶剂，DMSO的极性最高，将影响酶分子侧链间的相互作用，使维持蛋白质分子构象的作用力发生变化，从而使酶活性部位柔性增加，利于酶功能发挥，因此对酶的激活作用也更强烈[15]。

图3 有机溶剂对Nmnat稳定性的影响

2.2 复合保护剂配方的优化

由表1结果可得，保护剂的最佳配比为山梨醇1.5 g/L，海藻酸钠1.0 g/L，DMSO 0.5%。在此条件下，复合保护剂优于单一保护剂，Nmnat相对酶活达到114.23%，由对照组的12.4%提高了101.83%，显著提高了酶的稳定性。

表1 复合保护剂正交实验结果

2.3 复合保护剂对Nmnat最适反应温度的影响

反应温度是影响酶活性的重要因素，保护剂的加入可能会改变酶液的最适反应温度，也可以扩大酶的应用范围，具有十分重要的现实意义[16]。

本实验进行了反应温度-残余相对酶活曲线的测定，如图4所示。反应温度相同时，添加复合保护剂的Nmnat的残余相对酶活均高于对照组；未加保护剂时，Nmnat最适反应温度为37 ℃，添加复合保护剂后，Nmnat最适反应温度由37 ℃提高到50 ℃，提高了13 ℃。显然，保护剂的加入的确能显著提高酶的热稳定性，提高其最适反应温度。

图4 复合保护剂对Nmnat最适反应温度的影响

2.4 不同温度下复合保护剂对Nmnat热稳定性的影响

复合保护剂对Nmnat热稳定性的影响结果如表2所示。从表2可看出，50 ℃保温1 h时，对照组酶活保留率为13.6%，而处理组仍然保留有46.8%；50 ℃保温2 h后，对照组酶活保留率仅为9.8%，而处理组仍保留34.3%；60 ℃保温2 h后，对照组已经检测不到酶活力，而含有保护剂的酶制剂样品仍保留20.9%，说明复合保护剂的添加起到了很好的保护作用，使Nmnat的耐热温度提高了10 ℃左右，此结果与徐莹等研究复合保护剂的添加使弹性蛋白酶的耐热温度由50 ℃提高到60 ℃[8]以及陈天祥等研究发现，添加复合保护剂后，菊粉酶的耐热温度提高了10 ℃[17]结果相吻合。

表2 复合保护剂对Nmnat热稳定性的影响

2.5 复合保护剂对Nmnat pH稳定性的影响

有研究表明保护剂的加入可以影响酶溶液的pH稳定性和酶活力大小，如复合保护剂的加入使α-半乳糖苷酶的pH稳定范围由4～6扩大为3～6[9]。

由图5可知，无论是否含有复合保护剂，Nmnat在pH 7.0～8.0之间都有良好的稳定性，而且加入保护剂的Nmnat活性明显高于对照组，尤其是在pH 6.0～7.5时，提高幅度为45.1%～47.8%，说明保护剂的加入使Nmnat的pH稳定范围扩大为6.0～8.0，将利于扩大Nmnat的应用范围。

图5 复合保护剂对酶pH稳定性的影响

2.6 低温条件下保护剂对Nmnat储存稳定性的影响

酶在低温条件下会由于冻结速率、低温效应以及微生物污染等因素，导致其二级和三级结构发生改变，进而变性失活[18]。有研究表明保护剂可以提高酶在低温条件下的稳定性，比如含有0.2%黄原胶、30 mmolNaCl和3%甘油的复合保护剂对糖化酶储存6个月的酶活相比对照组(60.2%)提高了24.6%[19]。

本研究将Nmnat在4 ℃下保存7 d、14 d、21 d和28 d，定期测定残余酶活，结果如图6所示。对照组和处理组酶活均随着时间的延长呈下降趋势。其中，处理组酶活明显高于对照组。Nmnat在4 ℃储存效果较好，4 ℃储存28 d后，酶活保留率为18.47%,处理组酶活保留率高达34.12%，相比对照组提高了15.65%，说明低温下保护剂起到了一定的保护作用。据此推测降低温度保存时, 含有保护剂的酶制剂的保存期限会更长。

图6 4 ℃下复合保护剂对Nmnat储存

3 结论

温度的升高、保存时间的延长都会使酶的活性降低。酶在纯的溶液中比在不纯的溶液中更容易变性，因此，一般在酶液中加入一定的保护剂可以适当的延长酶的活性。本研究得出以下结论：

(1)单因素实验结果显示山梨醇、海藻酸钠以及DMSO可以显著提高Nmnat的活性。复合配方正交实验结果表明当山梨醇、海藻酸钠以及DMSO复合添加量分别为 1.5 g/L，1.0 g/L和0.5%时，酶活提高幅度最大，相对酶活达到 114.23%，与对照组相比提高101.83%，且均优于单一保护剂的保护作用。

(2)复合保护剂的加入使酶的最适反应温度由37 ℃提高到50 ℃，pH的使用范围从7.0～8.0扩大到 6.0～8.0；60 ℃保温2 h后，对照组已经检测不到酶活力，而含有保护剂的酶制剂样品仍保留20.9%，说明复合保护剂对酶起到了较好的保护作用；低温保存实验证明，4 ℃储存28 d后，添加复合保护剂的酶活保留率高达34.12%，相比对照组提高了15.65%。

总之，本研究通过添加保护剂显著提高了Nmnat的稳定性，后续研究可通过酶的固定化、酶修饰等技术来进一步提高Nmnat的热稳定性。

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Effects of protective agents on stability of NMN

adenylyltransferase fromEscherichiacoli

DUAN Lin-lin, LI Hong-mei

University of Shanghai for Science and Technology, School of Medical Instrument and

Food Engineering,Yangpu 200093，Shanghai，China

In order to enhance the stability and storage stability of NMN adenylyltransferase (Nmnat)，protective additives were added into the preparation of Nmnat, thereby expanding the scope of the use of enzymes. Some kinds of protective agents: solid alcohols (sorbitol, mannitol), sugar (sodium alginate, sucrose, mannose) and organic solvent (DMSO, propylene glycol-single ether, ethanol, glycerol) were investigated. The optimal combination additive (1.5 g/L sorbitol, 1.0 g/L alginate, 0.5% DMSO) was obtained using the orthogonal experimental design. And the thermal stability, optimum reaction temperature, optimum reaction pH, the storage stability of Nmnat with combination additive were discussed. These additives might increase the optimal reaction temperature from 37 ℃ to about 50 ℃ due to their good protection effects, the activity increased by 24.5% after preservation for 2 hours at 50 ℃, the range of pH stability from 7.0～8.0 expanded to 6.0～8.0, the residual activity of Nmnat containing combination additive increased 15.65% after storing at 4 ℃ for 28 days.

Nmnat; protective agents; thermal stability; orthogonal experiment

段琳琳(1990～)，女，硕士研究生。研究方向：微生物资源利用。E-mail:duanlinlin0303@163.com。

*通讯作者: 李红梅，博士，硕士生导师。Tel：021-55271117，E-mail: sunnysand@126.com。