延边某地长角血蜱和全沟硬蜱体内东方泰勒虫的分子生物学检测

李鸣，金春梅，李红旺，孙经宇，宋贺，赵冠姝，于龙政

（延边大学农学院动物医学系，吉林延吉133000）

延边某地长角血蜱和全沟硬蜱体内东方泰勒虫的分子生物学检测

李鸣，金春梅，李红旺，孙经宇，宋贺，赵冠姝，于龙政

（延边大学农学院动物医学系，吉林延吉133000）

为调查吉林省延边地区自然生境内游离蜱携带东方泰勒虫的情况，以东方泰勒虫主要表面蛋白基因（MPSP）基因为靶基因，采用PCR方法对延边地区自然生境内的游离蜱DNA进行扩增。在长角血蜱的DNA中检测了东方泰勒虫，检出率为29%；而全沟硬蜱中没有检测到东方泰勒虫。结果表明，自然生境中的游离长角血蜱体内携带着东方泰勒虫。

蜱；东方泰勒虫；长角血蜱；全沟硬蜱

东方泰勒虫（Theileria orientalisi）旧称瑟氏泰勒虫（Theileria sergenti），隶属孢子虫纲、梨形虫亚纲、梨形虫目、泰勒科、泰勒属的血液原虫，寄生于红细胞或淋巴细胞内，引起东方泰勒虫病，该病临床症状以高热、消瘦、贫血、出血和体表淋巴结肿大为主［1］。东方泰勒虫病是广泛分布于世界各地，感染该病的牛常常会成为病原体的携带者，直接影响牛的健康发育和牛类产品的产量与质量［2］。蜱是一类寄生在哺乳动物、鸟类、爬行类和两栖类脊椎动物体表的节肢动物，在刺叮宿主，吸食血液传播人和多种动物疾病，对人畜造成很大危害［3］。据报道，蜱可携带或传播83种病毒、14种细菌、18种螺旋体、32种原虫、1种支原体、1种巴尔通氏体［4］。目前牛东方泰勒虫病引起了国内外兽医界的广泛关注，对牛东方泰勒虫的流行病调查增多，但多数集中在对牛体内的东方泰勒虫的调查，而对自然生境游离蜱体内东方泰勒虫的调查较少。本研究采用PCR方法，对吉林省延边地区游离蜱进行东方泰勒虫检测，旨在分析东方泰勒虫在自然生境内的流行情况。

1材料与方法

1.1样本来源2014年5月-7月，在吉林省延边地区采集的游离蜱，经鉴定为长角血蜱和全沟硬蜱［5］。

1.2蜱DNA的提取将蜱用超纯水反复冲洗、剪碎，用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取蜱DNA，操作步骤按照说明书进行。

1.3引物根据Yu等（2011）报道［6］，合成特异性扩增东方泰勒虫MPSP基因的引物，分别为TsU 5′-CACGCTATGTTGTCCAAGAG-3′，TsR 5′-TGTGAGACTCAATGCGCCTA-3′，扩增片段长度853 bp。1.4PCR扩增PCR扩增体系为20 μL：10×PCR Buffer 2 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各2 μL，DNA 2 μL，ddH2O 9.8 μL，rTaq酶0.2 μL。反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，进行35个循环，最后72℃延伸7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5PCR产物判定阴性阳性PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，通过紫外凝胶成像仪观察结果，在875 bp处得到单一条带的视为阳性，无目的条带的视为阴性。

2结果

2.1牛东方泰勒虫PCR扩增牛体表长角血蜱和全沟硬蜱的DNA进行牛东方泰勒虫特异性表面蛋白MPSP基因进行PCR检测，结果从长角血蜱的DNA中扩增出牛东方泰勒虫特异的DNA片段，大小约为875 bp，与预期结果一致（见图1），但未能从全沟硬蜱的DNA中扩增出牛东方泰勒虫特异的DNA片段（数据未显示）。

图1长角血蜱体内牛东方泰勒虫MPSP基因PCR扩增

2.2MPSP基因的序列测定与同源性分析测序结果表明，长角血蜱DNA中扩增出的MPSP基因的长度为875 bp，包含一个完整阅读框，共编码283个氨基酸（图2）。应用DNAStar软件将长角血蜱体内扩增的MPSP基因与GenBank中查到的东方泰勒虫甘肃宁县株（FJ515689）、吉林珲春株（HQ322618、HQ322619、HQ322620、HQ322621）的MPSP基因进行比较分析，核苷酸序列的同源性为88.3%～99.8%（图3）。

2.3蜱体内牛东方泰勒虫的感染情况随机对14只长角血蜱和6只全沟硬蜱进行了PCR扩增，来检测牛东方泰勒虫。其中全沟硬蜱没有检测到牛东方泰勒虫，14只长角血蜱有4只检测到了牛东方泰勒虫，感染率为29%。

图2长角血蜱体内东方泰勒虫MPSP部分基因序列及推导的氨基酸序列

图3MPSP基因核苷酸同源性比较分析

3讨论

近年来，随着我国养牛业的不断发展和牛只在不同牧区、不同省份之间的频繁运输，东方泰勒虫病的发生呈上升趋势。在疫区，外地引进牛只东方泰勒虫病发病率和致死率均较高，给畜牧业带来了较大的经济损失。蜱是牛东方泰勒虫的传播媒介，已知能传播东方泰勒虫蜱有长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）、嗜群血蜱（H.concinna）和日本血蜱（H.japonica）3种，经过我们调查在吉林省延边地区存在长角血蜱和全沟硬蜱［5］。本试验提取了长角血蜱和全沟硬蜱的DNA，通过PCR鉴定，初步判定延边地区自然环境中的长角血蜱含有东方泰勒虫的DNA，感染率为29%，而在全沟硬蜱DNA中没有检测到东方泰勒虫。东方泰勒虫在自然界的长角血蜱体内是存在的，对放牧牛有潜在的感染风险，因此要加强对放牧牛的体表驱蜱工作。

DNA是生物体主要的遗传物质，其基本功能是遗传信息的传递和表达。对DNA的来源的鉴定可以帮助我们对病原体的检测。东方泰勒虫可以存在长角血蜱的马氏管中，其核酸可以通过PCR方法检测到，但是因为含量少，所以有效的提取方法有助于病原体的检测。本试验采用DNA试剂盒提取蜱的基因组DNA，通过DNA试剂盒法替代传统的乙醇沉淀法提取基因组DNA，尽可能避免在传统乙醇沉淀过程中因DNA沉淀不完全而导致的DNA损耗，获取最大量的基因组DNA。

牛东方泰勒虫MPSP基因是一种保守性蛋白基因，该基因在良性泰勒虫属中已作为流行病学调查和系统发育学研究的标志性蛋白基因［2］。引物的特异性和敏感性对病原体的检测很重要。本试验中用到TsU和TsR引物是扩增东方泰勒虫MPSP的基因，MPSP基因锚定在东方泰勒虫表面，含量相对丰富。TsU和TsR是一对检测东方泰勒虫特异性引物，广泛用于东方泰勒虫的检测，提高了试验的准确性。

［1］杨艳玲，张西臣，张国才，等.牛东方泰勒虫P32主要表面蛋白基因的克隆与分析［J］.寄生虫与医学昆虫学报，2007，04: 204-207.

［2］Inoue M，Van Nguyen D，Meas S，et al.Survey of Theileria parasite infection in cattle in Cambodia and Vietnam using piroplasm surface protein gene-specific polymerase chain reaction［J］.J Vet Med Sci，2001，63（10）：1155-1157.

［3］Chen Z，Yang X，Bu F，et al.Ticks（acari：ixodoidea:argasidae，ixodidae）of China［J］.Exp Appl Acarol，2010，51（4）：393-404.

［4］Nava，S，Guglielmone A A，Mangold A J，et al.An overview of systematics and evolution of ticks［J］.Front Biosci（Landmark Ed），2009，14（1）：2857-2877.

［5］于龙政，海旭南，许应天，等.吉林省延边地区自然生境内蜱种类的调查［J］.国际医学寄生虫病杂志，2015，42（1）：22-23.

［6］Yu L，Zhang S，Liang W，et al.Epidemiological survey of Theileria parasite infection of cattle in Northeast China by allele-specific PCR［J］.J Vet Med Sci，2011，73（11）：1509-1512.

TheMolecular detection ofTheileria orientalisiinHaemaphysalis longicornisandIxodes persulcatusin Yanbian area

LI Ming，JIN Chun-mei，LI Hong-wang，SUN Jing-yu，SONG He，ZHAO Guan-shu，YU Long-zheng
（Department of Veterinary Medicine，Yanbian University，Yanji 133002，China）

In order to investigate the existence of Theileria orientalisi in free ticks in Yanbian area of Jilin province，the polymerase chain reaction（PCR）method was used to amplify major piroplasm surface protein（MPSP）gene of T.orientalisi.The MPSP gene was detected in Haemaphysalis longicornis DNA，and the detection rate was 29%.However，the MPSP gene was not detected in Ixodes persulcatus DNA samples.The results showed that the free H.longicornis in the natural habitat of Yanbian carried the T.orientalisi.

tick；Theileria orientalisi；Haemaphysalis longicornis；Ixodes persulcatus

YU Long-zheng

S857.74+6

A

0529-6005（2016）08-0090-02

2015-08-12

延边大学科技计划项目（201518）；延边大学大学生第七届科研项目（ydbksky2015227）；吉林省现代农业产业技术体系建设专项（201534）

李鸣（1995-），男，本科生，就读于动物医学专业，E-mail：389404597@qq.com

于龙政，E-mail：lzyu@ybu.edu.cn