安徽番鸭细小病毒的分离和PCR检测

戴银，张丹俊，沈学怀，赵瑞宏，胡晓苗，侯宏艳，潘孝成，周学利

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥230031）

安徽番鸭细小病毒的分离和PCR检测

戴银，张丹俊，沈学怀，赵瑞宏，胡晓苗，侯宏艳，潘孝成，周学利

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥230031）

为研究安徽省番鸭细小病毒遗传变异状况，通过番鸭胚接种分离了安徽流行株，并进行PCR检测。将扩增基因序列AH-MDPV-1和AH-MDPV-2在NCBI数据库中进行相似性搜索比对，结果显示，两者与番鸭细小病毒基因同源性均大于99%；与鹅细小病毒基因同源性分别介于79%～90%和78%～81%之间。进一步将AH-MDPV-1与7条参比的细小病毒基因序列进行比对，可见番鸭细小病毒的该部分基因相对较为保守，而与鹅细小病毒基因相应区域具有明显差异，表明该基因特异性较强，可以作为番鸭细小病毒的鉴定依据。同时可判定该病毒分离株为番鸭细小病毒。

番鸭细小病毒；病毒分离；PCR检测

番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovlrus，MPV）引起的急性传染病，主要侵害1-3周龄的雏番鸭，又称3周病。病雏番鸭常表现为喘气、消瘦、拒食、软脚和腹泻等主要临床症状，剖检可见消化道及小肠部位病变。该病具有高度的传染性，其发病率较高，死亡率可达50%～80%；且少数病愈鸭生长缓慢，大多成为“僵鸭”［1-2］。番鸭细小病毒病最早由我国学者林世堂等发现，随后国内外不断有相关的研究报道［3-6］。目前，番鸭细小病毒病已是严重危害番鸭养殖业的主要疫病，我国多地雏番鸭大量死亡，造成了严重的经济损失。近期安徽省部分番鸭群也发现了类似病症，且呈现暴发的趋势，为进一步研究番鸭细小病毒的流行发病趋势和遗传进化特征，更好地防控该病，我们采集了病料，并进行了病毒分离和PCR鉴定，以及初步的基因序列分析。

1材料与方法

1.1材料非免疫健康番鸭胚，购自非疫区；病料来源于安徽省某养鸭场，具明显番鸭细小病毒病症状的番鸭。DNA提取试剂、Taq酶、dNTP等PCR试剂，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2方法

1.2.1引物设计经Oligo6.0软件分析，参照GenBank数据库中登录的番鸭细小病毒基因序列（登录号：KM093740），及已发表的文献［7-8］，设计两对特异性扩增引物。P-1：5′-AAGAGAAAGAAAACCCGT-3′，P-2：5′-GTTGCCTCCAAAGGAGGTA-3′；P-3：5′-TGTACCCTTCTATGGCTGTG-3′，P-4：5′-TTCTCCATATCATCAATAG-3′。两个预期扩增片段大小分别为624 bp和900 bp。扩增的目的片段分别命名为AH-MDPV-1，AH-MDPV-2。引物

由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2.2病毒的分离取疑似番鸭细小病毒病病料组织研磨，经过处理制成滤过液接种12日龄番鸭胚，弃去24 h前死亡的胚胎，收集72～120 h之间死亡的胚胎尿囊液。

1.2.3基因组DNA的提取按常规方法提取总基因组DNA［8］。将尿囊液经5 000 r/min离心10 min，取上清，分别加入10%SDS至终浓度为2%，再加蛋白酶K至50 μg/mL，充分混匀，37℃水浴2 h后，用等量饱和酚抽提1次，再用等量饱和酚-氯仿抽提2次，用等体积氯仿抽提1次，加入1/10体积3 mol/L NaAC（pH值5.2）和2倍体积预冷的无水乙醇，16 000 r/min离心10 min，沉淀病毒核酸，TE（pH值8.0）溶解，-20℃保存备用。

1.2.4基因的扩增以提取的基因组DNA为模板，分别采用P1、P2和P3、P4为上下游引物，扩增基因AH-MDPV-1和AH-MDPV-2。PCR反应体系：10× PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 3.0 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，加双蒸水补足60 μL。按以下程序进行扩增：94℃预变性4 min；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10 min。扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.5基因序列分析测序后的基因序列在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）数据库中进行相似性比对搜索，选择番鸭和鹅细小病毒株（goose parvovirus，GPV）共7条参比序列作为分析样本，登录号分别为番鸭JF926695，鹅EF515837，番鸭U22967，番鸭KC171936，X75093，鹅EU5833 92，鹅U34761。使用Clustal X 1.83软件比对序列，采用DNAStar、MegAlign等软件分析各序列同源性。

2结果

2.1病毒的分离从接种病料的番鸭胚中分离出1株病毒，可见病变胚体发育受阻，全身出血，胸和背头部均有充、出血点，尤以头部出血更为严重，胚体死亡时间在3～7 d。

2.2基因组DNA的提取由电泳图可见，所提取的两个样品基因组DNA在2 000 bp上方均有明显的DNA条带（图1），虽然部分条带有部分降解拖尾现象，但由于PCR的高敏感性，该模版完全能够满足后续试验的要求。

2.3番鸭AH-MDPV基因的扩增以提取的基因组DNA为模板，P1、P2和P3、P4为引物PCR扩增，分别获得了一条约600 bp和900 bp大小的特异性DNA片段（图2），与预期目的片段大小相符。将扩增的基因产物纯化、测序。测序结果与Gen-Bank中登录的相应基因序列进行比对。

图1基因组DNA电泳图

图2AH-MDPV基因的PCR扩增

2.4同源性分析将获得的两个基因序列AHMDPV-1和AH-MDPV-2分别在NCBI数据库中进行相似性搜索比对，结果显示，两者与番鸭细小病毒基因同源性均大于99%；除个别鹅细小病毒基因序列外，AH-MDPV-1和AH-MDPV-2与鹅细小病毒同源性均相对较低，分别介于79%～90%和78%～81%之间。随后从中选择7条参比序列，与AH-MDPV-1进行比对（图3）。可见与AHMDPV-1同源性最高的是来自于国内番鸭细小病毒株的基因序列KC171936，为99.8%，最低是鹅细小病毒株序列U34761。进一步序列分析可见番鸭细小病毒的该部分基因相对较为保守，仅有个别碱基发生突变，而与鹅细小病毒相应区域则差异显著，表明该基因特异性较强，可以作为鉴定依据。因此，可判定该次分离的安徽病毒株为番鸭细小病毒。

3讨论

3.1随着番鸭养殖业的规模化发展，病毒的不断更新变异，番鸭细小病毒已经成为危害世界番鸭养殖业较为严重的病毒之一［9］。本研究通过非免疫健康番鸭鸭胚分离了番鸭细小病毒，并进行PCR检测，序列分析显示，扩增序列AH-MDPV-1与鹅细小病毒相应序列差异明显，证实为番鸭细小病毒基因组特异基因。同时可见AH-MDPV-1与所比较的番鸭细小病毒毒株的基因序列均大于99%，最高的是来自于国内番鸭细小病毒毒株的基因序列KC171936。研究结果表明，安徽流行的番鸭细小病毒毒株与国内的部分流行株同源性较高，可能来自于共同祖先，但主要毒力相关基因是否发生变异，还需要进一步深入研究。

3.2鹅细小病毒是小鹅瘟的烈性传染病的病原，鹅细小病毒既能感染鹅又可以感染番鸭，同样是危害极为严重的疫病之一。研究结果可见番鸭与鹅细小病毒毒株同源性总体相对较低，基因序列同源性仅介于82.1%～86.5%之间。但研究表明，鹅细小病毒与番鸭细小病毒的病毒形态结构、基因组、病理变化和临床症状等方面较为相似，在实际生产中小鹅瘟雏鹅活疫苗和抗血清也能够提高雏番鸭对MDPV的抵抗能力［7-8，10］。同时，有研究发现，鹅细小病毒和番鸭细小病毒与细小病毒属其他成员特征差异较大，但却与依赖病毒属的腺联病毒关系密切，他们可能来源于共同的祖先，且可能是自主细小病毒与依赖细小病毒进化的“联接点”［11］。尽管鹅细小病毒与番鸭细小病毒有很多相似的特点，但感染的寄主却有差异，说明两者在抗原特征上存在差异。血清检测也证实番鸭细小病毒与鹅细小病毒抗原差异性很大。接下来我们将进一步克隆获得番鸭细小病毒非结构蛋白和结构蛋白的完整基因，深入研究其遗传学特点、抗原性差异及病毒致病机理为该病的预防控制奠定基础。

图3基因序列分析

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Separation and PCR Detections of Muscovy Duck Parvovirus in Anhui

DAI Yin，ZHANG Dan-jun，SHEN Xue-huai，ZHAO Rui-hong，HU Xiao-miao，HOU Hong-yan，PAN Xiao-cheng，ZHOU Xue-li
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei 230031，China）

To investigate the variation status of muscovy duck parvovirus in Anhui province，the Anhui epidemic strain was isolated from the muscovy duck embryo，and then was identified by PCR sequence analysis.The sequence similarity of AH-MDPV-1 and AH-MDPV-2 genes were analyzed，and the gene homology between Anhui strain and the other Muscovy duck parvoviruses all were 99%.However，the homology between both genes and genes of goose parvovirus ranged from 79%to 90%and from 78%to 81%，respectively.Alignment of AH-MDPV-1 and 7 gene sequences from NCBI database，the genes of Muscovy duck parvoviruses were relatively conservative，but obvious difference was observed between Muscovy duck parvoviruses and goose parvoviruses. The result indicated that AH-MDPV-1 was the specific gene of Muscovy duck parvovirus，and could be used for gene identification.

Muscovy duck parvovirus；Separation；PCR for detection

ZHANG Dan-jun

S852.65+9.2

A

0529-6005（2016）08-0035-03

2015-04-15

国家自然科学基金项目（31302044）；国家蛋鸡产业技术体系项目（CARS-41）；安徽省现代农业肉禽产业发展资金项目和院科技创新团队（11C0404）资助

戴银（1980-），女，助理研究员，博士，主要从事兽医微生物与免疫学研究，E-mail：daiyin2020@163.com

张丹俊，E-mail：zhangdj694@sina.com