适用于双向电泳的杨树叶片蛋白质提取方法的研究

严 冬 刘殿昆 司冬晶 郑 密 赵曦阳 曲冠证 李 莹

(东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040)

适用于双向电泳的杨树叶片蛋白质提取方法的研究

严 冬 刘殿昆 司冬晶 郑 密 赵曦阳 曲冠证 李 莹*

(东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040)

为了获得分离效果好、清晰度高的杨树叶片蛋白质双向电泳图像，本研究以小黑杨、毛果杨和84K杨叶片为材料，采用三氯乙酸—丙酮沉淀法、Tris-饱和酚法和Tris-三氯乙酸法提取杨树叶片总蛋白质，分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向凝胶电泳对蛋白质进行分离，应用Image Master 2D Platinum 6.0软件对这3种蛋白质提取方法得到的双向电泳凝胶进行分析。结果表明：Tris-三氯乙酸法最适用于双向电泳的杨树叶片蛋白质的提取。利用Tris-三氯乙酸法提取蛋白质得到的鲜样中总蛋白质平均含量为949.46 μg·g-1，得到的蛋白质点平均数量为567个，所得到的双向电泳凝胶图谱分离效果好、清晰度高。

杨树叶片；Tris-三氯乙酸法，蛋白质提取；双向凝胶电泳

双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术是蛋白质组学研究中分析和分离复杂蛋白质样品最有效的手段之一[1]。近年来双向电泳技术已经广泛应用于不同植物组织器官中蛋白质的差异研究[2～3]、植物病理学研究[4]，以及植物对逆境反应的分子机理研究等[5～6]。目前关于不同材料的蛋白质样品的制备研究已有很多报道[7～8]，较常见的全蛋白提取方法有尿素—硫脲提取法、Tris-HCl法、酚法、Tris-丙酮-酚法、Trizol沉淀法和TCA丙酮沉淀法等。植物叶片含有大量的多酚、色素、多糖等次生代谢物质，直接影响蛋白样品制备的质量，从而导致双向电泳分离效果不佳[9～10]，因此提取高质量且含量丰富的叶片全蛋白是研究植物叶片蛋白质组学的前提和基础。

杨树(Populus)是世界上广泛栽培的重要造林树种[11]，是林木研究的模式树种[12～13]。杨树基因组计划的完成使其基因组学研究取得了不断的进步[14～15]，而蛋白质作为生命活动的主要承担者[16]，蛋白质组学研究也具有很高的价值。高质量蛋白质样品的制备是进行蛋白质组学研究的前提，因此建立一种适用于杨树叶片蛋白质提取的方法是进行杨树蛋白质组学研究首要解决的问题。本研究以不同派别杨树的3个无性系(小黑杨(PopulusX)、毛果杨(P.trichocarpaTorr.& Gray)和84K杨(银腺杨，P.alba×P.glandulosa))为材料，利用三氯乙酸—丙酮沉淀法、Tris-饱和酚法及Tris-三氯乙酸法提取这3个无性系叶片的蛋白质，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向电泳对蛋白质进行分析，比较3种蛋白质提取方法对杨树叶片蛋白质的提取效果，并得到Tris-三氯乙酸法是适用于双向电泳的杨树叶片蛋白提取的最佳方法，该方法可获得高含量高质量的叶片总蛋白质，可用于杨树叶片蛋白质组学的研究并为其他木本植物叶片蛋白质样品的制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验所用实验材料是东北林业大学温室扦插培养的小黑杨、毛果杨和84K杨，于扦插第3个月采集自茎尖起第3～5片叶片，叶片采摘下后立刻放入液氮速冻处理，放入-80℃冰箱保存。

1.2 杨树叶片蛋白质样品的制备

取3份1 g保存在-80℃冰箱的杨树叶片，在预冷研钵中加入液氮研磨，以研磨到浅色粉末状为最合适。

1.2.1 三氯乙酸—丙酮沉淀法

将粉末转入到离心管中放在冰上，加入3倍体积预冷的丙酮溶液(10%三氯乙酸和0.07% β-巯基乙醇)，震荡30 min，在-80℃冰箱保存1 h。将沉淀后的样品放入低温高速离心机，12 000 g，4℃，离心20 min，弃上清。将沉淀重悬于3倍体积预冷的丙酮溶液中(0.07% β-巯基乙醇)，颠倒混匀，在-20℃冰箱保存1 h。再将样品放入低温高速离心机，12 000 g，4℃，离心20 min，弃上清。将沉淀重悬于3倍体积预冷的丙酮溶液中(0.07% β-巯基乙醇)，颠倒混匀，在-20℃冰箱保存1 h。再将样品放入低温高速离心机，12 000 g，4℃，离心20 min，弃上清。将样品真空干燥后，加入200 μL双向电泳裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，1%二硫苏糖醇)充分溶解蛋白质。12 000 g，室温下离心20 min，取上清，-80℃冰箱保存。

1.2.2 Tris-饱和酚法

将粉末转入到离心管中放在冰上，加入3倍体积的蛋白质提取液(0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH8.8)，10 mmol·L-1乙二胺四乙酸，0.4% β-巯基乙醇，0.9 mol·L-1蔗糖)震荡10 min，加入等体积的Tris-饱和酚，冰浴震荡30 min。再将样品放入低温高速离心机，12 000 g，4℃，离心20 min，取酚相(上层液)。余下的沉淀和液体再加入Tris-饱和酚，颠倒混匀。再将样品放入低温高速离心机离心20 min，取酚相，并将酚相收集到同一离心管中。向酚相中加入3倍体积的甲醇(0.1 mol·L-1的醋酸铵)溶液，充分混匀，在-20℃沉淀过夜。将样品放入低温高速离心机，12 000 g，4℃，离心20 min，弃上清，沉淀用甲醇溶液(0.1 mol·L-1的醋酸铵)洗涤并将样品放入低温高速离心机，12 000 g，4℃，离心20 min，弃上清，重复洗沉淀1～2次。将沉淀真空干燥，加入200 μL双向电泳裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，1%二硫苏糖醇)充分溶解蛋白。12 000 g，室温下离心20 min，取上清，-80℃冰箱保存。

1.2.3 Tris-三氯乙酸法

在预冷研钵中加入0.1 g pvp-40和叶片混合，液氮研磨叶片，将粉末转入到离心管中放在冰上，并加入3倍体积预冷的丙酮溶液。将样品放入低温高速离心机，12 000 g，4℃，离心20 min，弃上清。沉淀中加入1 mL lysis buffer(50 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.8)，2 mmol·L-1乙二胺四乙酸，10% Triton X-100，0.1% β-巯基乙醇)，超声波破碎细胞后，再将样品放入低温高速离心机，12 000 g，4℃，离心20 min。蛋白质溶液中加入5倍体积预冷的丙酮溶液(10%三氯乙酸和0.07% β-巯基乙醇)，-80℃保存1 h。将样品放入低温高速离心机，12 000 g，4℃，离心20 min，弃上清。使用1 mL预冷的丙酮溶液(0.07% β-巯基乙醇)清洗沉淀，重复1次。将沉淀真空干燥后，使用200 μL双向电泳裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，1%二硫苏糖醇)充分溶解蛋白。12 000 g，室温下离心20 min，取上清，-80℃冰箱保存。

1.3 蛋白质含量测定

本实验采用改良的Bradford法简便快速测定出微量蛋白浓度[17]。

1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳在Bio-rad Mini-PROTEAN Ⅱ(Bio-rad)上进行，电泳条件为：15 mA，30 min；30 mA至溴酚蓝到达胶底部。采用银染法对聚丙烯酰胺凝胶进行染色。将凝胶置入固定液(40%乙醇，10%冰乙酸)中，于水平摇床上固定30 min。除去固定液，加入致敏液(30%乙醇，0.2%硫代硫酸钠，6.8%乙酸钠，0.125%戊二醛)，致敏30 min。除去致敏液，用纯水洗涤3次，每次10 min。除去溶液，加入银染液(0.25%硝酸银，0.015%甲醛)，染色20 min。除去银染液，用纯水洗涤2次，每次1 min。将胶转入显色液(2.5%碳酸钠，0.0075%甲醛)中，待蛋白点显色至清晰程度时即可除去显色液加入终止液(14.6% EDTA-Na2·2H2O)。

1.5 双向凝胶电泳

第一向等电点聚焦采用24 cm，pH3-10非线性的IPG胶条，上样体积为450 μL。取300 μg蛋白质样品加入水化槽中，放入胶条，在胶条上覆盖2 mL矿物油，盖上水化槽的盖子并将水化槽放置于等电聚焦电泳仪中，进行等电聚焦。等电聚焦程序如表1所示，整个过程在20℃下进行。

表1等电聚焦程序

Table1Theprogramofisoelectricfocusingelectrophoresis

步骤Steps电压Voltage(V)升压模式Mode时间Time(h)Step150快速StepandHold15Step2500快速StepandHold5Step31000线性Gradient1Step48000线性Gradient3Step58000快速StepandHold3．75

等电聚焦结束后，将IPG胶条放入含有10 mg·mL-1DTT的平衡液(75 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.8)，6 mol·L-1尿素，2%二硫苏糖醇，30%丙三醇，0.002%溴酚蓝)平衡30 min，将平衡好的IPG胶条放入含有25 mg·mL-1碘乙酰胺的平衡液中平衡30 min，将平衡好的IPG胶条转移至14%的聚丙烯酰胺凝胶上，用1%琼脂糖固定，进行第二向电泳分离。电泳条件：5 W，40 min；15 W至溴酚蓝到达凝胶底部，采用银染对电泳胶进行染色。

1.6 图像扫描和分析

凝胶染色后，用GE ImageScanner Ⅲ扫描仪对凝胶进行图像扫描，分辨率为300 dpi。用Image Master 2D Platinum 6.0软件对图像进行分析。选取母胶，去除背景，运行自动斑点检测，得出最终的结果。

1.7 统计分析方法

利用SPSS(Statistical Program for Social Sciences)19.0[18]软件对3种蛋白质提取方法提取的3种杨树叶片蛋白质总量进行方差分析，线性模型为:

xij=μ+Ci+Bj+eij

(1)

式中，μ为总体平均值，Ci为树种效应，Bj为方法效应，eij为环境误差。

2 结果与分析

2.1 杨树叶片蛋白质提取总量的分析

用三氯乙酸—丙酮沉淀法、Tris-饱和酚法、Tris-三氯乙酸法分别提取小黑杨、毛果杨和84K杨叶片蛋白质，利用Bradford法测定叶片蛋白质含量(表2)。通过对叶片蛋白质总量的计算表明三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-三氯乙酸法提取的蛋白质总量高于Tris-饱和酚法。利用SPSS 19.0软件对所得到的叶片蛋白质总量进行分析，结果表明，不同树种间(F=41.78**)及不同蛋白质提取方法间(F=37.35**)蛋白质总量差异均达极显著水平(P<0.01)。利用三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-三氯乙酸法所提取小黑杨叶片蛋白质总量为Tris-饱和酚法的2倍。利用三氯乙酸—丙酮沉淀法所提取毛果杨叶片蛋白质总量为Tris-饱和酚法的3.5倍，利用Tris-三氯乙酸法所提取毛果杨叶片蛋白质总量为Tris-饱和酚法的2倍。利用三氯乙酸—丙酮沉淀法所提取84K杨叶片蛋白质总量为Tris-饱和酚法的1.9倍，利用Tris-三氯乙酸法所提取84K杨叶片蛋白质总量为Tris-饱和酚法的1.2倍。以上结果说明，三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-三氯乙酸法能从等量的杨树叶片中获得的蛋白质总量更多，更适用于杨树叶片蛋白质的提取。

表2 3种蛋白质提取方法提取的杨树叶片蛋白质总量

图1 3种蛋白质提取方法提取的杨树叶片蛋白质总量Fig.1 The protein amount of three extracting methods

2.2 杨树叶片蛋白质提取质量的分析

利用3种方法提取3种杨树叶片蛋白质，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳以及银染染色，通过图像扫描得到电泳图谱。如图2所示，Tris-三氯乙酸法提取所得到的3种杨树叶片蛋白条带丰富清晰，蛋白质主要分布在10～50 kD，50 kD以上的大分子量蛋白清晰分布。三氯乙酸—丙酮沉淀法提取的3种杨树叶片蛋白均有降解，特别是大分子量蛋白。Tris-饱和酚法提取的小黑杨叶片蛋白质发生降解，同样方法提取的毛果杨和84K杨蛋白条带少，分子量分布不均匀。总之，Tris/三氯乙酸法所提取的杨树叶片蛋白质质量最高，电泳图蛋白条带最清晰，蛋白质种类最丰富。因此，利用Tris/三氯乙酸法可以获得更完整的杨树叶片蛋白质，该方法最适用于双向电泳的杨树叶片蛋白质的提取。

图2 3种蛋白质提取方法提取的杨树叶片蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳图 1,4,7. TCA丙酮沉淀法；2,5,8. Tris-饱和酚法；3,6,9. Tris/三氯乙酸法Fig.2 The SDS-PAGE image of the proteins extracted by three extracting methods 1,4,7. TCA/Acetone precipitation; 2,5,8. Tris/saturated phenol; 3,6,9. Tris/TCA

2.3 杨树叶片蛋白质的双向电泳结果的分析

利用3种方法提取3种杨树叶片蛋白质，经过IPG胶条等电聚焦后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及银染染色，通过图像扫描得到电泳图谱如图3所示。由图3可见，Tris-三氯乙酸法的背景比三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-饱和酚法的背景浅，横向纵向条纹少，得到的蛋白质点也多。通过Image Master 2D Platinum 6.0软件对蛋白质电泳图进行分析，得到了3种方法提取的蛋白质点的数量(表3)。在以小黑杨叶片为材料得到的电泳图中，Tris-三氯乙酸法所得蛋白质点为三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-饱和酚法的1.5倍。在以毛果杨叶片为材料得到的电泳图中，Tris-三氯乙酸法所得蛋白质点为三氯乙酸—丙酮沉淀法的2.8倍，是Tris-饱和酚法的3.2倍。在以84K杨叶片为材料得到的电泳图中，Tris-三氯乙酸法所得蛋白质点为三氯乙酸—丙酮沉淀法的2.4倍，是Tris-饱和酚法的1.9倍。Tris-三氯乙酸法所得的3种杨树蛋白质的双向电泳图谱都非常清晰，分离效果好，且蛋白质点数量多。因此，Tris-三氯乙酸法最适用于杨树叶片蛋白质的双向电泳，能够有效的对杨树蛋白质组研究提供支持。

图3 3种蛋白质提取方法提取的杨树叶片蛋白质的双向电泳图 a～c.小黑杨；d～f.毛果杨；g～i. 84K杨 a,d,g. 三氯乙酸—丙酮沉淀法；b,e,h. Tris-饱和酚法；c,f,i. Tris-三氯乙酸法Fig.3 The 2-DE images of the proteins extracted by three extracting methods a-c.Populus X; d-f.P.trichocarpa Torr. & Gray; g-i.P.alba×P.glandulosa a,d,g. TCA/Acetone precipitation; b,e,h. Tris/saturated phenol; c,f,i. Tris/TCA

表33种蛋白质提取方法提取的杨树叶片蛋白的双向电泳图蛋白质点的数量

Table3Thenumberofproteinspotsextractedbythreeextractingmethodsinthe2-DEimages

品种Varieties三氯乙酸—丙酮沉淀法TCA/AcetoneprecipitationmethodTris⁃饱和酚法Tris/saturatedphenolmethodTris⁃三氯乙酸法Tris/TCAmethod小黑杨PopulusX296297435毛果杨P．trichocarpaTorr．&Gray20618457384K杨P．Alba×P．glandulosa293360694

3 讨论

植物蛋白质提取技术一直是植物蛋白质组学研究中需要解决的关键问题，不同的植物组织结构及成分不同，适用的蛋白质提取方法也不相同。本研究利用三氯乙酸法—丙酮沉淀法、Tris-饱和酚法和Tris-三氯乙酸法分别提取小黑杨、毛果杨和84K杨叶片总蛋白质，结果表明，不同方法提取的相同质量杨树叶片的总量有很大差异，所得样品的电泳结果差异很明显。

三氯乙酸—丙酮沉淀法在动物、植物蛋白提取上有广泛应用，是常用的植物叶片提取方法，但是难以清除样品当中的酚类、醛类物质，使得电泳图像上产生纵向条带，从而掩盖部分蛋白质点与条带，导致电泳时蛋白点与条带缺失较多[19]。在本实验中，此方法耗时较长，提取的得到的蛋白质发生降解，并且在双向电泳图像上产生严重的横向和纵向条带，蛋白质分离效果差。Tris-饱和酚法的实验步骤相对复杂，所得蛋白总量少，对叶片蛋白的提取效果差。Tris-三氯乙酸法法实验步骤简单，耗时较少，提取蛋白条带丰富清晰，双向电泳的蛋白质点数量最多也最清晰。

同时，相对于三氯乙酸法—丙酮沉淀法和Tris-饱和酚法，Tris-三氯乙酸法在研磨叶片时加入了pvp-40，其可以络合多酚类物质，防止多酚类物质氧化成醌类物质，具有一定的抗氧化作用，也有报道认为pvp在去除多糖方面有一定功效[20～21]。之后应用了超声波破碎的技术对样品粉末进行了处理，使样品粉末更加细致，使样品可以与溶液更充分的接触，从而提高了样品的提取质量。在先前，Islam等人发现，提取成熟水稻叶片蛋白质时，使用超声处理可以改善样品质量和双向电泳的分离效果[22]。该方法与赵相涛、袁坤等人使用的改良三氯乙酸法相比[23～24]，先使用了蛋白裂解液溶解蛋白，能更好的保护蛋白，防止蛋白损失。以上研究结果表明，Tris-三氯乙酸法可以有效去除干扰电泳效果的各类杂质，从而从相同质量的叶片样品中提取出品质更优于其他两种方法的蛋白质，是最适合杨树叶片双向电泳蛋白质提取的方法，可用于杨树叶片蛋白质组学的研究并为其他木本植物叶片蛋白质样品的制备提供参考。

1.O’Farrell P H.High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins[J].J Biol Chem,1975,250(10):4007- 4021.

2.Komatsu S,Konishi H.Proteome analysis of rice root proteins regulated by gibberellin[J].Genomics,Proteomics & Bioinformatics,2005,3(3):132-142.

3.Nozu Y,Tsugita A,Kamijo K.Proteomic analysis of rice leaf,stem and root tissues during growth course[J].Proteomics,2006,6(12):3665-3670.

4.Chen F,Yuan Y X,Li Q,et al.Proteomic analysis of rice plasma membrane reveals proteins involved in early defense response to bacterial blight[J].Proteomics,2007,7(9):1529-1539.

5.Manaa A,Ahmed H B,Valot B,et al.Salt and genotype impact on plant physiology and root proteome variations in tomato[J].Exp Bot,2011,62(8):2797-2813.

6.Chen Q,Zhang M D,Shen S H.Comparison of protein extraction methods suitable for protemics analysis in seedling roots ofJerusalemartichokeunder salt(NaCl) stress[J].Afr.J.Biotechnol.,2011,10(9):7650-7657.

7.Damerval C,Vienne D D,Zivy M,et al.Technical improvements in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat seedling proteins[J].Electrophoresis,1986,7(1):52-54.

8.刘海衡,胡胜武,刘胜毅,等.油菜不同器官高质量总蛋白提取方法和双向电泳体系的优化[J].中国油料作物学报,2009,4(4):426-433.

Liu H H,Hu S W,Liu S Y,et al.Optimization of high quality total protein extraction and two-dimensional gel electrophoresis system for differentBrassicanapusorgans[J].Chinese journal of oil crop sciences,2009,4(4):426-433.

9.Saravanan R S,Rose J K C.A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues[J].Proteomics,2004,4(9):2522-2532.

10.Carpentier S C,Witters E,Laukens K.Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues:An evaluation of different methods for two dimensional gel electrophoresis analysis[J].Proteomics,2005,5(10):2497-2507.

11.张颖,王猛,柴娜.杨树叶片离体再生系统的构建[J].山东农业科学,2010,5:8-10.

Zhang Y,Wang M,Chai N.Establishment of in vitro regeneration system of poplar leaves[J].Shangdong Agricultural Sciences,2010,5:8-10.

12.Bradshaw HD,Ceulemans R,Davis J,et al.Emerging model system in plant biology:poplar(Populus) as a model forest tree[J].Journal of Plant Growth Regulation,2000,19(3):306-313.

13.Taylor G.Populus:Arabidopsis for forestry.Do we need a model tree?[J].Ann.Bot.2002,90(6):681-689.

14.Tuskan G A,DiFazio S,Jansson S,et al.The genome of black cottonwood,Populustrichocarpa(Torr.&Gray)[J].Science,2006,313(5793):1596-1604.

15.Tuskan G A,DiFazio S ,Teichmann T.Poplar genomics is getting poplar:the impact of the poplar genome project on tree research[J].Plant Biology,2004,6(1):2-4.

16.Guo Y M,Shen S H,Jing Y X,et al.Plant proteomics in the post-genomicera[J].Act a Bot Sin,2002,44(6):631-641.

17.Ramagli L S,Link A J.Methods in molecular biology[M].Totowa:Humana Press,1999.

18.时立文.SPSS 19.0统计分析从入门到精通[M].清华大学出版社,2012:28-29.

Shi LW.SPSS 19.0 statistical analysis from entry to the master[M].Tsinghua university press,2012:28-29.

19.李晓琳,邵爱娟,陈敏,等.酸浆种子蛋白提取方法的比较研究[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(1):14-17.

Li X L,Shao A J,Chen M,et al.Comparison of protein extraction methods for the semen seu sructus shysalis[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2010,16(1):14-17.

20.王卓伟,余茂德,鲁成.PVP在桑叶总DNA提取中的应用[J].西南大学学报:自然科学版,2001,23(1):61-62.

Wang Z W,Yu M D,Lu C.Application of PVP in total DNA extraction in mulberry[J].Journal of Southwest Agricultural University(Natural Science Edition),2001,23(1):61-62.

21.Muhammad A Lodhi,Guang-Ning Ye,Norman F Weeden,et al.A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars and Vitis species[J].Plant Molecular Biology Reporter,1994,12(1):6-13.

22.Islam N,Lonsdale M,Upadhyaya N M,et al.Protein extraction from mature rice leaves for two-dimensional gel electrophoresis and its application in proteome analysis[J].Proteomics,2004,4(7):1903-1908.

23.赵相涛,吕全,赵嘉平,等.一种适合杨树树皮的蛋白质提取方法[J].山东农业科学,2012,44(7):121-123.

Zhao X T,Lü Q,Zhao J P,et al.A protein extraction method suitable for poplar bark[J].Shangdong Agricultural Sciences,2012,44(7):121-123.

24.袁坤,王明庥,黄敏仁.一种适合杨树叶片的蛋白质提取方法[J].南京林业大学学报:自然科学版,2007,31(3):119-121.

Yuan K,Wang M X,Huang M R.A method suitable for protein extraction of poplar leaves[J].Journal of Nanjing Forestry University(Natural Science Edition),2007,31(3):119-121.

Fund program of science fund project of returned overseas of Heilongjiang(LC2013C09);Research Funds for the Central Universities(DL13BA09)

introduction：YAN Dong(1991—),male,Master,major in proteomics of poplar and tamarix chinensis.

date:2015-12-03

OptionalProteinExtractingMethodsofPoplarLeavesforTwo-dimensionalGelElectrophoresis

YAN Dong LIU Dian-Kun SI Dong-Jing ZHENG Mi ZHAO Xi-Yang QU Guan-Zheng LI Ying*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

In order to obtain the two-dimensional gel electrophoresis images with better separation and definition of poplar leaves, thePopulusX,P.trichocarpaTorr. & Gray andP.alba×P.glandulosawere selected to study the optional extracting methods of poplar leaves for two-dimensional gel electrophoresis by using TCA/acetone precipitation, Tris/saturated phenol and Tris/TCA method, respectively. The proteins of poplar leaves were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and two-dimensional gel electrophoresis respectively and the images of two-dimensional gel electrophoresis were analyzed by Image Master 2D Platinum 6.0. Tris/TCA method was more appropriate for the protein extraction of poplar leaves for two-dimensional gel electrophoresis. The average protein content of the fresh sample extracted by Tris/TCA method was 949.46 μg·g-1and the average quantity of protein spots was 567 in the two-dimensional gel electrophoresis images which had better separation and definition.

poplar leaves;protein extraction;Tris/TCA method;two-dimensional gel electrophoresis

黑龙江省留学归国科学基金项目(LC2013C09)；中央高校基本科研业务费(DL13BA09)

严冬(1991—)，男，硕士研究生，主要从事杨树、柽柳蛋白组学研究工作。

* 通信作者：E-mail:xlbtdl@163.com

2015-12-03

* Corresponding author：E-mail:xlbtdl@163.com

S792.11

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.022