益肾方对IgA肾病细胞因子表达的实验研究

王三合　 康晓玲　樊　平　陈　群

西北工业大学医院(西安710072)



益肾方对IgA肾病细胞因子表达的实验研究

王三合 康晓玲樊平陈群

西北工业大学医院(西安710072)

目的：观察益肾方对IgA肾病模型大鼠细胞因子表达的影响。方法：将40只SD大鼠随机分为正常对照组10只，造模组30只两组，采用口服牛血清白蛋白联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B法造模。将IgA肾病模型大鼠分成3组：益肾方组、造模组、强的松治疗组各10只。分别灌胃给药，4周后取血，酶联免疫法(ELISA)测定IL-6、Leptin和PDGF水平。结果：与模型组比较，各药物治疗组均有IL-6、Leptin和PDGF表达降低作用；与正常对照组比较，各组IL-6、Leptin和PDGF表达均增强(P<0.05)；与模型组比较，益肾方能显著降低IL-6、Leptin和PDGF的表达。 结论：益肾方可能是通过降低IL-6、Leptin和PDGF的表达治疗IgA肾病。

IgA肾病(IgA nephrophathy, IgAN)是我国最常见的原发性肾小球疾病，发病率占原发性肾小球疾病的58.2%，是全世界发病率最高的原发性肾小球疾病，也是慢性肾脏病的主要病理类型[1]。近年研究发现，众多细胞因子与IgA肾病的发生、发展及转归关系密切，而白细胞介素-6(IL-6)是细胞因子网络中的重要因子之一[2]。目前，有关细胞因子与IgA肾病的关系已成为研究的热点。本实验通过观察益肾方对IgA肾病模型大鼠IL-6、Leptin和PDGF指标的变化，从细胞因子水平探讨益肾方治疗IgA肾病的可能机制，为益肾方的临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物21日龄幼年Sprague-Dawley (SD) 大鼠40只，体重100±50g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。

1.2动物模型的建立正常对照组大鼠自由进食与饮水，而模型组大鼠隔日灌服BSA200mg/kg体重(BSA用0.1%BSA酸化水溶解)，第6周开始按20mg/kg,1次/d尾静脉注射1%BSA(每1gBSA溶于1250ml注射用水中，配成含BSA0.4mg/0.5ml的溶液)连续3d，第8周时按0.5mg/kg尾静脉注射SEB，每周1次(1 mg SEB溶于50ml注射用水，配成每0.5ml注射用水含0.01mg SEB的溶液)，连续注射3周，观察至12周末。

1.3分组及药物干预模型大鼠分三组，每组10只，正常对照组10只。将模型大鼠30只随机分成3组：益肾方组(汤剂容量为每次每公斤体重10ml)、模型组(灌以相同剂量的清水)、强的松治疗组(0.1mg/100g)；1次/d，连续4周。

1.4取材实验的第12周末和第16周末用代谢笼收集大鼠24h尿液进行尿总蛋白测定。采用腹主动脉取血分离血清，-20℃保存。

1.5检测指标及方法采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)试剂盒测定血清样本中IL-6、Leptin、PDGF-BB水平，严格参照试剂盒说明书进行操作。计算血清IL-6、Leptin和PDGF水平。

2结果2.1正常对照组大鼠在实验过程中，一般情况正常，模型组大鼠在造模时，注射SEB后均有不同程度的食欲减少，精神萎靡等表现。造模第12周末收集大鼠尿液进行检测，见表1。

表1　各组大鼠第12周末尿红细胞计数、24h

注：与正常对照组比较*P<0.05

2.2各组大鼠治疗4周后血清细胞因子检测结果结果显示，与正常对照组比较，各组尿液中红细胞个数和24h尿蛋白定量均较正常对照组显著增加，各治疗组之间血尿与蛋白尿水平无显著性差异(P>0.05)，显示造模成功。

表2　各组大鼠治疗4周后血清细胞

注：*表示与正常对照组比较具有统计学差异，#表示与模型组比较具有统计学差异

2.3各组大鼠第16周末尿红细胞计数、24h尿蛋白定量结果治疗4周后对IL-6、Leptin、PDGF-BB的检测结果,见表2。尿红细胞计数、24h尿蛋白定量结果，见表3。

表3　各组大鼠第16周末尿红细胞计数、24h

注：*表示与正常对照组比较具有统计学差异，#表示与模型组比较具有统计学差异与模型组比较，强的松组、益肾方组大鼠尿红细胞、24h尿蛋白均有降低(P<0.05)，强的松组、益肾方组尿红细胞、24h尿蛋白测定结果无统计学差异

3讨论目前IgAN动物模型建立方法有以下几种：自发病变型、免疫诱导型和继发病变型。自发病变型采用ddy小鼠和高IgA小鼠，而这种小鼠价格昂贵，且该小鼠肾脏与人类肾脏组织结构差别较大；免疫诱导型多采用尾静脉注射葡萄球菌肠毒素+灌胃牛血清白蛋白(BSA)诱发IgAN[3]，但葡萄球菌肠毒素是外毒素易引起机体损害,还有采用皮下注射注射CCL4和蓖麻油，灌胃牛血清白蛋白及尾静脉注射0.05mg脂多糖(LPS)，诱发IgA肾病模型，该模型模型虽有较强IgA的沉积，但肝功能损害严重，常伴有肝细胞坏死变性和假小叶生成[4]。

继发病变型则采用体外将MOPC-315杂交瘤的二硝基苯酚抗体与牛血清白蛋白(二硝基苯酚化)配成免疫复合物，通过鼠静脉注入BAIb/c鼠体内，而致免疫复合物沉积在肾小球系膜区，但此法模型动物血尿不明显[4]。

本研究采用尾静脉注射葡萄球菌肠毒素+灌胃牛血清白蛋白(BSA)诱发IgAN，考虑到葡萄球菌肠毒素易引起机体损害，改为0.5mg/kg尾静脉每周注射一次以减少损伤，从研究结果看造模成功。有研究结果显示一般在造模12周左右可建立稳定、可靠的IgA肾病模型。因此，本研究在造模12周时代谢笼留尿检测模型动物血尿和尿蛋白情况以确定动物模型是否成功，在模型成功后进行药物干预4周以观察药物治疗效果。

IgAN目前治疗以糖皮质激素及细胞毒药物为主，但有时这些药物的副作用让患者较难接受。中医药治疗IgAN有一定疗效。

本方为肝肾阴虚之方，证属肾中真水不足，水亏无以养木，而致阴虚阳亢且虚火内生，治疗宜采用滋补肝肾，方中熟地具有甘柔补血，滋肾填精之功，当归补血活血为君药，山茱萸、枸杞子、女贞子滋养肝肾固肾气为臣药，黄芪可补气升阳，山药健脾益胃可助运化，茯苓渗利脾湿，而丹皮凉肝泻火，生地、赤芍、白茅根具有清热凉血之用，小蓟凉血止血、金樱子固精、旱莲草滋阴、仙鹤草收敛共为佐使。全方补泻结合，开合相济，共奏滋阴补肾固精、清热凉血活血之功效。

肾穿刺活检是诊断IgA肾病的金标准，近年来超声引导下肾活检使肾活检的安全性得到提升，本研究采用的肾穿刺均是在超声引导下进行的，但是肾穿刺活检是有创性检查，有发生出血等风险，且肾穿刺活检结果有时不足以准确评估肾小球病变严重程度。因此，寻找能够用于IgA肾病诊断、病情评估或判断预后的无创性生物标志物已成为研究热点[5]。

细胞因子IL-6是由T细胞、B细胞、单核巨噬细胞等分泌的糖蛋白，具有多种生物学活性，研究发现IL-6可增加系膜细胞蛋白激酶的活性，加重肾损害[6]。本研究结果显示：IgA肾病模型大鼠血清IL-6水平明显高于正常对照组，两者比较有显著性差异(P<0.05)；服用益肾方治疗后，IL-6水平显著下降，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。提示IL-6表达升高是IgA肾病的生物标记物之一，益肾方可降低IL-6的表达促进组织修复。

总之，本研究结果提示，IL-6、Leptin和PDGF水平与临床肾间质病理损伤之间具有一定的相关性。血清IL-6、Leptin和PDGF水平可作为无创性生物标记物，若能有大数据样本检测结果支持，血清IL-6、Leptin和PDGF水平有可能成为IgA肾病诊断、病情评估或判断预后的无创性生物标志物。

[1]Zhou FD，Zhao MH，Zou WZ，et al．The changing spectrum of primary glomerular diseases within 15 years: a survey of 3331 patients in a single Chinese centre[J]. Nephrol Dial Transplant,2009,24(3):870-876．

[2]王楠楠，卜茹，蔡广研，等.IgA肾病相关尿液无创性生物标志物的研究进展[J].中华肾病研究电子杂志，2015，4(2)：37-41.

[3]贺敏敏，董晨，李俊霞.I gA肾病小鼠模型的建立与鉴定[J].徐州医学院学报，2010，30(3)：151-154.

[4]陆慧瑜，张巧玲,蒋小云，等.IgA肾病大鼠模型的建立[J].中国误诊学杂志，2011，11(6)：1264-1267.

[5]孙燕，穆喆，高妍婷，等.肾活检1363例病理谱分析[J].陕西医学杂志，2014，43(10)：1413-1415.

[6]何泽云，廖春来，何雅琴，等.六味地黄汤对IgA肾病大鼠IL-6及TNF-α表达的影响[J].上海中医药大学学报，2015，29(3)：61-65.

(收稿2016-04-03；修回2016-06-16)

The experimental study on the effects of cytokine expression of Yishen-Fang in IgAN rats

Hospital of northwestern polytechnical university

(Xi’an 710072)WangSanheKang XiaolingFan Ping et al

Objective：To observe the effects of cytokine expression of Yishen-Fang treatment in IgAN rats. Methods： 40 SD rats were randomly divided into two groups, 10 for normal control group, 30 for model group. 30 IgAN rats were randomly divided into 3 groups: Yishen-Fang treatment group, model group, prednisone treatment group. There are 10 rats in each group. After Gavage for four weeks, the blood was collected. The IL-6, Leptin and PDGF values were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results：Compared with the model group, the expression of IL-6, Leptin and PDGF values decrease were shown in all drug treatment groups. Compared with the normal control group, the values of IL-6, Leptin and PDGF in each group were significantly increased(P<0.05). The expression of IL-6, Leptin and PDGF in the Yishen-Fang treatment group was significantly reduced when compared with the model group. Conclusion:Yishen-Fang may treat the IgAN rats by reducing the expression of IL-6, Leptin and PDGF.

Kidney Diseases (TCM)/Chinese traditional medicine therapyYishen-FangAnimal ExperimentationRats

*陕西省中医管理局项目(13-LC085)

西安交通大学医学部地方病研究所(西安710000)

肾病/中医药疗法益肾方 动物 ，实验大鼠

R692

A doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.079

陕西省卫生计生委研究项目(2014ZD072)

△西安市新城区中医医院(西安710003)

▲陕西省中医医院(西安710003)