补肾中药复方对缺血性损伤大鼠薄型子宫内膜厚度及组织病理学的影响

李　楠　陈　梅　李　翡　孙　康

陕西中医药大学附属医院(咸阳712000)



·实验研究·

补肾中药复方对缺血性损伤大鼠薄型子宫内膜厚度及组织病理学的影响

李楠陈梅李翡孙康

陕西中医药大学附属医院(咸阳712000)

目的：观察补肾中药复方对缺血性损伤致薄型子宫内膜模型大鼠子宫内膜厚度及组织病理学的影响。方法：SD实验大鼠随机分为4组，分别为空白对照组、模型组、西药组和中药组。除空白对照组以外，其余3组均采用阻断卵巢动脉的方法建立“缺血性损伤”薄型子宫内膜模型，造模成功后空白对照组和模型组给予生理盐水灌胃，西药组给予小剂量阿司匹林灌胃，中药组灌服补肾中药复方，连续灌胃15d后处死。结果：模型组与空白对照组比较,子宫内膜厚度明显萎缩变薄，其差异具有统计学意义；西药组和中药组的内膜厚度与模型组比较均增加，中药组增加的幅度更显著，差异有统计学意义，但与空白对照组比较，无统计学意义。同样，中药组与西药组比较，虽然显示出明显增厚的趋势，但差异无统计学意义。镜下观察模型组子宫内膜层变薄，腺体数量减少，排列疏松，间质致密、细胞变少、变小，血管分布稀疏。西药组和中药组子宫内膜腺体数量较模型组均明显增加，间质血管分布密度集中。而中药组内膜腺体及间质血管发育较西药组成熟度更高。结论：阻断卵巢血供后子宫内膜发生缺血性改变，可以导致内膜厚度变薄。补肾中药复方在增加薄型子宫内膜厚度改善其组织形态中发挥着与小剂量阿司匹林相似且较优的效应。

30余年来，人类辅助生殖技术(Assisted reproduction technique，ART)经过不断的发展成熟,给越来越多的不孕夫妇带来了福音。然而在助孕周期中仍有相当一部分患者因为各种原因以失败告终，其中子宫内膜过薄导致的子宫内膜容受性的改变是重要的原因之一。国外学者研究发现：子宫内膜血流减少与不明原因薄型子宫内膜发生有关。我们已通过阻断卵巢动脉减少子宫内膜血供的方法成功建立了“缺血性损伤”薄型子宫内膜动物模型。本研究将基于此探讨补肾中药复方对该模型动物子宫内膜厚度及组织病理学的影响，旨在为补肾法及补肾中药用于不孕症及妇科内分泌疾病患者提供重要参考及依据。

1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物及分组:6-8周龄SD雌性大鼠，体重180-200g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号：合格证号：SCXK(陕)2012-003。大鼠被随机分为4组：空白对照组、模型组、西药组和中药组，每组10只。

1.1.2 实验药物:补肾中药复方组成：主要成分由紫河车、菟丝子、枸杞子、熟地、当归、黄芪等共100g，药物均为配方颗粒剂，购自陕西中医药大学附属医院。阿司匹林肠溶片(25mg/片，陕西白鹿制药厂)。

1.1.3 主要试剂和仪器:苏木素、伊红染色液(碧云天生物技术研究所)；4%多聚甲醛、1%HCl-75%乙醇、碱液、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、丙三醇、二甲苯、PBS(中国国药集团)；冷冻切片机(Leica公司 CM3050S)；倒置显微镜(Leica公司 IX71)。

1.1.4 动物模型建立:运用10%水合氯醛腹腔注射(0.3ml/100g体重)麻醉大鼠，腹部常规消毒后，打开腹腔，暴露子宫，用微动脉夹阻断双侧卵巢动脉血供20min，随后恢复血流，逐层关腹，1个动情周期后进行实验动物灌胃。

1.1.5 给药方法和剂量:按照60kg成人与大鼠等效剂量比率为1:6，计算出大鼠灌胃剂量。中药组：10g/kg·d，按1ml/100g灌胃；西药组：小剂量阿司匹林0.5mg/kg·d，按1ml/100g灌胃；空白对照组及模型组每日灌服生理盐水1ml/100g。各组大鼠连续灌胃15d后，剖腹取子宫。

1.2方法1.2.1大鼠子宫内膜厚度测定及组织病理学变化的观察将大鼠断颈处死，75%乙醇中浸泡消毒5-10min。无菌条件下，小心剖取大鼠子宫，-20℃保存。将大鼠子宫包裹于包埋剂后，于冷冻切片机上进行冷冻切片，设置切片厚度为5um。选取平整的切片进行HE染色。将切片于4%多聚甲醛中固定10～30s，水洗。染苏木素3～5min，水洗。1%HCl-75%乙醇分化5～10s，水洗。碱水促蓝20s，水洗。伊红染色30～60s，水洗。80%乙醇洗3～5s，95%乙醇洗3～5s，无水乙醇洗3～5s，丙三醇封片。结果判定：子宫内膜厚度采用Leica Qwin Plus图像处理软件对HE染色后组织切片进行测量。形态学变化运用光镜观察子宫内膜厚度、腺体及螺旋动脉分布、腺上皮细胞形态、间质细胞形态变化。

2结果2.1各组大鼠子宫内膜厚度比较 模型组与空白对照组比较,子宫内膜厚度明显萎缩变薄，其差异具有统计学意义(P<0.05),说明阻断卵巢血供后子宫内膜发生缺血性改变，可以导致内膜厚度变薄。西药组和中药组的内膜厚度与模型组比较均增加，中药组增加的幅度更显著，差异有统计学意义(P<0.05)，但与空白对照组比较，无统计学意义(P>0.05)。同样，中药组与西药组比较，虽然显示出明显增厚的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1　各组大鼠子宫内膜厚度比较

注：与模型组比较，*P<0.05

2.2各组大鼠子宫内膜组织病理学变化与空白对照组比较，模型组子宫内膜层变薄，腺体数量减少，排列疏松，腺上皮细胞完整，呈单层立方上皮，间质致密、细胞变少、变小，大部分区域血管分布稀疏。西药组和中药组子宫内膜厚度及腺体数量较模型组均明显增加，间质血管分布密度集中。而中药组内膜腺体及间质血管发育较西药组成熟度更高。 见图1。

3讨论胚胎成功的着床有赖于一定厚度的子宫内膜提供营养，这是良好妊娠结局的保证。相对于较厚的子宫内膜而言，排卵后子宫内膜厚度<7～8mm时其临床妊娠率、继续妊娠率均明显降低，这一点被大量的临床研究证实[1-5]。到底在种植窗口期子宫内膜厚度需要达到多少，才可以引起胚泡成功植入，目前对这一具体数值的界定尚不统一，多数学者认为子宫内膜厚度至少>7mm，是获得妊娠的前提[6]，当内膜厚度<6mm则很难获得妊娠[7]。 Richer[8]等曾对子宫内膜厚度与妊娠结局之间的关系进行研究：1294个IVF周期中，在排除患者的年龄和种植胚胎数及质量因素后，发现妊娠组HCG 日子宫内膜厚度较非妊娠组厚：内膜 6～8mm者妊娠率为53%，而内膜>16mm者妊娠率升高至77%，活产率或继续妊娠率从44%增高到67%。近年来国内研究者也尝试应用各种方法增加子宫内膜厚度以达到提高妊娠率的目的获得成功[9-11]。由此证明子宫内膜的厚度是影响辅助生殖技术结局的关键因素之一。

目前有关薄型子宫内膜的确切发生机制尚不清楚，也无统一的诊断标准，因此近年来并未形成规范化的临床治疗方案。但国外研究者Mina[12-13]等人对薄型子宫内膜血流及内膜生长相关因子进行研究发现了内膜薄的共性特征：内膜血流阻力增加，血供减少导致腺上皮细胞发育受损以及血管内皮生长因子(VEGF)表达下降，后者分泌减少造成子宫内膜血管生长不良，进而又会影响内膜的血流。此过程循环往复，最终导致内膜生长受限表现为薄型子宫内膜。内膜阻力增加作为始动因素的原因不明，但通过给予改善血流的药物后，内膜血流阻力下降，VEGF表达上调，子宫内膜增厚，进一步证实了子宫内膜缺血、血供减少是薄型子宫内膜的原因之一。

本研究基于上述薄型子宫内膜病理生理学机制，通过阻断卵巢动脉有效减少子宫动脉的血液供应，使子宫内膜处于低流量灌注状态建立薄型子宫内膜动物模型。实验证明，与空白对照组比较,子宫内膜厚度明显萎缩变薄，腺体数量减少，腺上皮细胞完整，呈单层立方上皮，间质致密、细胞变少、变小，血管分布稀疏。说明阻断卵巢血供后子宫内膜发生缺血性改变，内膜厚度变薄、腺体及血管发育不良。在分别给予模型动物小剂量阿司匹林及补肾中药复方后，两组模型动物内膜腺体数量、间质血管密度、内膜厚度均增加。在促进子宫内膜厚度增加方面，虽然与小剂量阿司匹林相比较，无显著性差异，但中药组变化的趋势更明显。小剂量阿司匹林能使子宫血流增加，子宫内膜腺体面积、腺腔周长间质面积和腺/间比值增大，使内膜增厚，改善薄型子宫内膜容受性及容受性相关因子表达[14]，对增加胚胎种植率有一定的帮助，具有临床应用价值。本研究结果表明，补肾中药复方在逆转薄型子宫内膜形态及功能中发挥着与小剂量阿司匹林相同且较优的效应。我们认为这与该复方具有的补肾填精，益气养血的功效密不可分。方中紫河车为血肉有情之品，生精益血，温补肾阳，温和而滋养力强；枸杞子、熟地、菟丝子补益肝肾，生精助阳；黄芪为补中升阳之要药，张锡纯谓之：其补益之功能生肌肉；当归养血活血，增加内膜生长的速度。全方补中有散，动静结合，温润并行，诸药合用，充分显现了改善缺血后子宫内膜血流、增加内膜厚度的作用。

由于受到研究水平的限制，人们对薄型子宫内膜发生机制认识还很有限，文献报道的各种治疗手段也都处于尝试性探索阶段。这为具有悠久历史及丰富经验的中医学提供了广阔的研究空间。中医药非线性调节的特点对该疾病的治疗已初步显现出整体疗效，但因其成分复杂，对其疗效机制的研究、作用路径及靶点的研究还有待于我们深入探讨。

[1]孔娜,刘景瑜,陈华,等.子宫内膜厚度和形态对体外受精/单精子注射-胚胎移植结果的预测[J].临床和实验医学杂志, 2013,(9):696-698.

[2]文华,李晓晴.HCG注射日子宫内膜厚度与IVF-ET临床妊娠率的相关性[J].中国优生与遗传杂志,2013,12(2):111.

[3] Paulson R J.Hormonal induction of endometrial receptivity[J].Fertil Steril, 2011,213:530-535.

[4]张合龙,李杭生,张少娣,等.厚度偏薄的子宫内膜对体外受精-胚胎移植及冻融胚胎移植妊娠率的影响[J].中国实用妇科与产科杂志,2011,(9):698-700.

[5]Ahlam,Al-Ghamdi,Serdar Coskun,et al.The correlation between endometrial thickness and outcome of in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET) outcome.Reprod Biol Endocrinol[J]. 2008,(6):37.

[6]Weissman A, Gotlieb L,Casper RF.The detrimental effect of increased endometrial thickness on implantation and pregnancy rates and outcome in an in vitro fertilization program[J].Fertil Steril,1999,71(1):147-149.

[7]Mikolajczyk M , Skizypczak J.Endometrial receptivity-can it diagnosed and controlled? And why does it matter? [J].Gnekol Pol,2014,85(2):149-153.

[8]Richer KS，Bugge KR, Bromero JG, et al. Relationship between and endometrial thickness and embryo implantation, based on 1294 cycles of invitro fertilization with transfer of two blastocust-stge embryos[J]. Fertil steria, 2007,87(1):53-59.

[9]赵诗艺,刘英,杨晓葵,等. 薄型子宫内膜冻融胚胎移植周期中应用雌二醇/雌二醇地屈孕酮的疗效观察[J].实用妇产科杂志,2015,31(4):270.

[10]薛惠英,仲纪祥,左阳花,等.盆底仿生物电刺激干预治疗薄型子宫内膜患者的冷冻胚胎移植结局[J].生殖医学杂志,2015,24(1):12.

[11]田小龙,陈薪,许丽娟,等. 他莫昔芬用于薄型子宫内膜患者冻融胚胎移植时子宫内膜准备的研究[J].中国实用妇科与产科杂志，2015,31(8):736.

[12]Mina I，Tamura H, Takasaki A, et al. Pathophysiologic features of “thin”endometrium[J].Fertility and sterility, 2009,91(4):998-1004.

[13]Akasaki A, Tamura H, Mina I, et al. Endometrial growth and uterine blood flow: a pilot study for improving endometrial thickness in the patients with a thin endometrium[J]. Fertility and sterility,2010,93(6):1851-1858.

[14]常亚杰. 辅助生殖技术周期中薄型子宫内膜的相关机制及临床对策[J].实用杂志,2014,30(11):822.

(收稿2016-04-20;修回2016-05-16)

Effect of kidney-reinforcing recipe on the thickness and histopathology of thin endometrium caused by Ischemic injury models in experimental rats

Affiliated Hospital of Shaanxi University Of Chinese Medicine

(Xianyang 712000 )Li Nan Chen MeiLi Feiet al

Objective：To observe kidney-reinforcing recipe on the thickness and histopathology of thin endometrium caused by Ischemic injury models in experimental rats.Methods：SD rats werer andomly divided into four groups, respectively blank control group, model group ,western medicine group and Chinese medicine group. All groups were established animal model of thin endometrium caused by Ischemic injury, but blank control group. After established model, blank control group and model group were given intragastric administration normal saline. Western medicine group was given low-dosage aspirine. Chinese medicine group was given. Gastric volume was 1ml/100g. all animals were put to death after 15days.Results:compared with blank control group, the thickness of endometrium of model group was obvious atrophy thinning. The difference was significant.The endometrial thickness were increased both western medicine group and Chinese medicine group compared with model group, the latter increased more significant.there was no difference with blank control group. Although showed obvious thickening trend in chinese medicine group, but There was no statistically significant difference compared with western medicine group. It was observed that endometrium was thinn ing, gland was fewer, loosely arranged. The stoma was less dense and vascular distribution was sparse in microscope. The number of endometrial glands both western medicine group and Chinese medicine group compared with model group were significantly increased, interstitial vascular distribution was density and Chinese traditional medicine group of endometrial glands and stroma vascular development maturity was higher than western medicine group.Conclusion Endometrial Ischemic injury caused by temporary interrupting the ovary artery blood supply will lead to endometrial thickness thinning. Kidney-reinforcing recipe can increase the thickness and form of thin endometrium and play a similar to low-dose aspirin and a better effect.

Kidney-reinforcing recipeThin endometriumEndometrial thicknessHistopathology

*陕西省科技厅自然科学基础研究项目(2013JQ4010)

补肾中药复方薄型子宫内膜子宫内膜厚度组织病理学

R96

A doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.078

陕西省教育厅自然科学科研计划项目(14JK1205)