光棘球海胆多肽的制备及其生物活性

王　婷，王晓慧，马　莹，季晓彤，王　玲，年益莹，薛　鹏，孟　双，秦　磊，李冬梅，张公亮，侯红漫，孙黎明，*

（1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 116034；3.山东东方海洋科技股份有限公司，山东 烟台 264003）

光棘球海胆多肽的制备及其生物活性

王婷1，2，王晓慧3，马莹1，2，季晓彤1，2，王玲1，2，年益莹1，2，薛鹏1，2，孟双1，秦磊1，2，李冬梅1，2，张公亮1，侯红漫1，孙黎明1，2，*

（1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 116034；3.山东东方海洋科技股份有限公司，山东 烟台 264003）

光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus）又称大连紫海胆，是我国主要的经济型海胆之一，其味道鲜美、营养丰富，具有较高的食用和药用价值。本实验以大连紫海胆为研究对象，采用酶解法制备海胆活性肽，并对其部分生物活性进行研究。使用木瓜蛋白酶对海胆黄进行水解，得到分子质量分布范围＜1、1～3、3～5、5～10 kD和＜10 kD的5 种海胆多肽组分。活性研究结果显示，在多肽终质量浓度为200 ☒g/mL时，不同分子质量分布的海胆多肽均可促淋巴细胞生长。在这一质量浓度下，除了小于1 kD的多肽，其他多肽均对人宫颈癌细胞（HeLa细胞）增殖有一定抑制作用，对腹腔巨噬细胞吞噬能力有一定促进作用。在多肽终质量浓度为50 ☒g/mL时，不同组分海胆多肽对叔丁基脂氢过氧化物所致的Chang肝细胞氧化损伤均可发挥直接和间接抗氧化保护作用。然而，不同分子质量分布的海胆多肽均可抑制补体的经典途径活性，且呈现明显剂量-效应关系。上述结果表明，海胆多肽对细胞免疫和体液免疫功能具有潜在的调节作用，其功能活性的多向性值得深入研究。

光棘球海胆；多肽；生物活性；人宫颈癌细胞

海胆属棘皮动物门（Echinodermata）海胆纲（Echinoidea），是一类常见的海洋无脊椎动物。海胆的生殖腺，俗称海胆黄，是海胆的可食部位，具有特殊鲜美的味道，而且富含蛋白质、油脂、多糖、色素等组分。《本草原始》和《中药志》都记载了海胆的药用作用［1］。从古至今，临床上用海胆治疗疾病主要应用其棘壳。而现代科学也对海胆黄的组分和功效进行了系统研究，无论是其水相和有机相提取物［2-3］，还是海胆油脂［4-5］、蛋白质［6］、多糖［7］等组分均具有较为明确的生物活性。

本研究室Qin Lei等［8］对大连紫海胆（Strongylocentrotus nudus）多肽的制备和抗氧化活性进行了研究，发现海胆肽的抗氧化活性主要与所用蛋白酶的种类有关，与中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶相比，木瓜蛋白酶水解所得海胆肽的抗氧化能力最强。因此，本实验在此基础上，应用木瓜蛋白酶制备不同分子质量范围的海胆多肽，对其部分生物活性进行探索，为海胆活性多肽的产业开发奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

大连紫海胆生殖腺由大连乾日海洋食品有限公司提供；SPF级Balb/c小鼠购自大连医科大学实验动物中心。

人宫颈癌HeLa细胞 中国科学院上海细胞库；脱纤维绵羊血 烟台品格林实验设备有限公司；健康人血浆大连市中心医院。

溶血素 郑州百基生物科技有限公司；木瓜蛋白酶、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT） 上海生工生物工程技术服务有限公司；RPMI-1640培养基、Hank’s溶液美国Thermo Fishier Scientific公司；胎牛血清、台盼蓝染液、青霉素、链霉素 美国Ameresco 公司；其他试剂均为分析纯或色谱纯。

1.2仪器与设备

LG-1.0型真空冷冻干燥机 沈阳新阳速冻设备制造有限公司；WKY型微量移液器、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；电热恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂；超滤膜、8050超滤搅拌器美国Milipore公司；AB204-N电子分析天平 梅特勒-托利多有限公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；UV2100型紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；快速自动平衡离心机 北京雷勃尔离心机有限公司；PHS-3C精密pH计 上海雷磁电子仪器厂；超低温冰箱、二氧化碳培养箱 日本三洋公司；立式压力蒸汽灭菌 上海博迅实业有限公司医学设备厂；KDN-102F自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司；倒置显微镜、显微镜 奥林巴斯公司；多孔酶标仪德国Tecan公司；超净工作台 哈东联公司；漩涡振荡器 上海精科实业有限公司；HH-4数显恒温水浴锅江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；WKY型微量移液器 上海求精仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1海胆基本组成成分的测定

根据 GB/T 5009.3—2010《食品中水分的测定》［9］中直接干燥法测定水分含量；根据 GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的测定》［10］中灼烧称质量法测定灰分含量；根据GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》［11］中凯氏定氮法（F=6.25）测定蛋白质含量；根据 GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》［12］中索氏抽提法测定脂肪含量；采用苯酚-硫酸法（以葡萄糖为标准）测定总糖含量［13］。

1.3.2海胆肽的制备

选用酶活力为37 500 U/g的木瓜蛋白酶，底物质量浓度为8 g/100 mL，加酶量为2 500 U/g底物，在48.8 ℃，pH 7.0条件下对海胆黄水解3 h。水解完成后煮沸灭酶10 min，2 000×g离心10 min收集上清液，首先用10 kD的超滤膜，截留分子质量小于10 kD的多肽，然后进一步利用5、3、1 kD的超滤膜，将其（＜10 kD的多肽）进行超滤分级，得到分子质量分布范围在5～10、3～5、1～3 kD 和＜1 kD的4 种多肽，经冷冻干燥后将各分子质量分布范围的组分于-20℃贮存备用。

1.3.3人宫颈癌HeLa细胞体外增殖的测定

采用MTT法［14］，取对数生长期的HeLa细胞，胰蛋白酶消化后用含体积分数10%的灭活的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 ☒g/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基，配成单个细胞悬液。细胞计数后，按照细胞浓度为1×105个/mL接种于96 孔培养板中，每孔180 ☒L，然后加入质量浓度分别为50、200 ☒g/mL的多肽样品溶液（用生理盐水配制并用微孔滤膜过滤）20 ☒L；阴性对照组加相应体积的生理盐水；每组设5 个平行孔；分别于37 ℃、5% CO2、湿度95%的培养箱中培养48 h，在培养结束前4 h，向每孔中加入20 ☒L的MTT溶液（5 mg/mL），继续孵育4 h，终止培养。1 500 r/min离心15 min，弃上清液，每孔加入150 ☒L二甲基亚砜，振荡后室温静置15 min，用酶标仪于570 nm 波长处测定光密度（OD）值。

1.3.4淋巴细胞增殖的测定

参考Sun Liming等［15］的方法制备脾脏淋巴细胞。颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，剔除脂肪和结缔组织，加入适量的Hank’s溶液，用灭菌的注射器针芯碾碎小鼠脾脏，经灭菌的200 目尼龙网过滤，收集含细胞的滤过液，经氯化铵破碎红细胞、Hank’s溶液洗涤后，获得小鼠脾脏淋巴细胞悬液。加入含10%胎牛血清的1640培养基，将细胞密度调整为3×106个/mL，以180 .L/孔的细胞、20 .L/孔的不同分子质量组分样品（终质量浓度为50、200 mg/L）接种于96 孔培养板中，设生理盐水为对照组，37 ℃、5% CO2、湿度95%培养箱中培养48 h，在培养结束前4 h，加入20 ☒L 5 mg/mL 的MTT溶液，后续过程同1.3.3节。

1.3.5腹腔巨噬细胞吞噬能力的测定

参考Kaur等［16］的方法制备腹腔巨噬细胞。在取腹腔巨噬细胞前，连续3 d每天给小鼠腹腔注射0.5 mL淀粉蛋白胨培养基（6 g/100 mL淀粉、0.3 g/100 mL牛肉膏、1 g/100 mL蛋白胨和0.5 g/100 mL NaCl）。第4天颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下剪开小鼠腹部外层皮肤，腹腔注入适量的Hank’s溶液，轻揉腹部后，用毛细吸管吸出腹腔液，收集后经破除红细胞和洗涤，得到小鼠腹腔巨噬细胞。调整细胞密度为1×106个/mL，以200 ☒L/孔接种于96 孔培养板，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h后，洗去未贴壁细胞，加入不同分子质量组分的样品（终质量浓度为50，200 mg/L），设生理盐水为对照组，继续放入培养箱中孵育2 h后，在每孔中加入100 ☒L滤过的1%中性红生理盐水溶液，0.5 h后离心弃上清液，用Hank’s液洗涤沉淀3 次后加入200 ☒L细胞裂解液（V（乙醇）∶V（乙酸）=1∶1），静置10 min后于450 nm波长处测定OD值。

1.3.6补体抑制作用的测定

采用补体结合实验，观察不同分子质量组分的海胆多肽对补体经典途径的影响［17］。致敏绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）悬液的制备：将绵羊血用缓冲液（glucose gelatin veronal buffer，GGVB）（0.141 mol/L NaCl、0.5 mmol/L MgCl2、0.15 mmol/L CaCl2、1.8 mmol/L巴比妥钠、0.1 g/100 mL明胶，pH 7.4）洗涤3 次，制成2%的SRBC悬液。与经1∶4 000稀释后的溶血素（2 U）等体积混匀， 37 ℃水浴孵育30 min，即为致敏SRBC悬液。

抗补体活性的测定：采用补体结合实验，将100 ☒L不同分子质量组分的多肽样品溶液（终质量浓度分别为100、50 mg/L），200 ☒L 1∶50稀释的人血清，200 ☒L GGVB混合，37 ℃水浴30 min后，加入100 ☒L制备的致敏SRBC溶液，37 ℃水浴30 min，1 000×g离心10 min。吸取200 ☒L上清液，用酶标仪于405 nm波长处测定OD值，设生理盐水代替多肽样品溶液为对照组。按下式计算多肽样品对SRBC（补体）的抑制能力。

式中：OD为多肽样品的光密度值；OD0为对照组的光密度值。

1.3.7细胞氧化损伤的保护作用测定

直接抗氧化作用的测定：取对数生长期的Chang 肝细胞，使用含10 g/100 mL的胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL链霉素的1640培养基，配成细胞密度为3×105个/mL的细胞悬液。在96 孔细胞培养板内，每孔添加180 μL细胞悬液后，加入多肽样品溶液20μL（样品终质量浓度为10、50 μg/mL），为样品组。空白组和叔丁基脂氢过氧化物（tert-butyl hydroperoxide；butylhydroperoxid，tBOOH）组均加入20 μL培养基代替多肽样品溶液。混匀后，除了空白组，其他各组均立即加入5 ☒L tBOOH溶液（8×10-5mol/L）。继续培养2 h，加入MTT溶液（5 mg/mL），后续过程同1.3.3节。

间接抗氧化作用的测定：细胞准备及分组同间接抗氧化作用，样品组加入多肽后，再培养20 h。之后除空白组，其他各组均加入5 ☒L tBOOH溶液（浓度为8×10-5mol/L）。继续培养4 h，加入MTT溶液（5 mg/mL），后续过程同1.3.3节。

1.4数据统计分析

2　结果与分析

2.1海胆黄干粉基本成分

本研究所用的海胆黄经冷冻干燥后测得干粉中的水分含量2.02%（以干基计）、粗蛋白含量40.36%、总糖含量20.93%、脂肪含量28.87%、灰分含量5.98%。结果表明，海胆黄干粉中蛋白含量较高，其次是油脂及碳水化合物等，具有较高的营养价值，这与Dincer等［18］对Paracentrotus lividus的基本组成研究结果相似。

2.2对人宫颈癌HeLa细胞体外生长的影响

图1　海胆多肽对人宫颈癌HeLa细胞生长的影响Fig.1　Effect of sea urchin peptides on the proliferation of HeLa cells in vitro

不同分子质量的海胆多肽对人宫颈癌HeLa细胞体外增殖的影响如图1所示，与对照组相比，当终质量浓度为50 ☒g/mL和200 ☒g/mL时，分子质量分布范围为1～3、3～5、5～10 kD的海胆多肽均能显著抑制HeLa细胞的生长（P＜0.05），但这3 种多肽的抑制能力无显著差异；另外，＜10 kD的海胆多肽在200 ☒g/mL时也可显著抑制HeLa细胞生长。

海胆的抗肿瘤活性早有报道，主要集中在海胆多糖和蛋白质提取物方面。高翼等［19］从光棘球海胆棘壳中分离出一种蛋白质，对人宫颈癌HeLa细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、胃癌SGC7901细胞、口腔上皮癌KB细胞和肺腺癌A549细胞都具有较强的生长抑制作用。刘纯慧等［20］制备的海胆黄多糖可显著抑制S180荷瘤小鼠体内肿瘤的生长，并可提高荷瘤小鼠免疫功能和抗氧化能力。张忠玲等［21-22］发现海胆提取物（一种糖脂）对SGC-7901人胃腺癌细胞和Bel7402人肝癌细胞的生长抑制作用是通过诱导其凋亡实现的。

本研究结果表明海胆多肽在较宽的分子质量范围内（1～10 kD）对HeLa细胞生长均具有比较稳定的抑制作用。组分分析显示，光棘球海胆黄中多糖含量高达20.93%，因此海胆多肽的抗肿瘤作用机制很可能与也是通过诱导凋亡实现的。

2.3对淋巴细胞增殖的影响

图2　海胆多肽对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响Fig.2　Effect of sea urchin peptides on lymphocyte growth

由图2可知，不同分子质量范围的海胆多肽在终浓度为200 ☒g/mL时显示出对体外小鼠脾淋巴细胞生长的促进作用，但是其作用效果与多肽分子质量之间无明显相关性。高辉等［2］报道了紫海胆提取物能够提高受试小鼠外周血的T淋巴细胞活力和腹腔巨噬细胞的吞噬功能。刘纯慧［23］和徐张展［24］等均发现海胆黄多糖能够促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖。因此可以推测，本实验所制备海胆多肽的促淋巴细胞生长作用与多肽中含有的多糖成分密切相关。

2.4对腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响

由图3可知，除分子质量＜1 kD的多肽组分外，其他组分的海胆肽在终质量浓度为 200 ☒g/mL时能够明显促进体外小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，其中3～5 kD的多肽组分作用最强。

图3　海胆肽对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响Fig.3　Effect of sea urchin peptides on the phagocytic activity of peritoneal macrophages

巨噬细胞的吞噬功能是机体非特异性免疫功能的重要组成部分，发挥免疫防御、监视、调节等多种免疫功能［25］。海胆多肽除了能够促进淋巴细胞的生长，还能够促进巨噬细胞的吞噬功能，表明海胆多肽对机体特异性和非特异性免疫功能均具有一定的调节功能。

2.5对补体经典途径的影响

图4　海胆多肽对补体经典途径活性的抑制作用Fig.4　Inhibitory effect of sea urchin peptides on classical complement pathway activity

由图4可知，不同分子质量范围的海胆多肽对补体均有一定的抑制作用。其中，1～3 kD的多肽组分抑制作用相对较高，当终质量浓度为50 ☒g/mL和200 ☒g/mL时，抑制率分别为24.36%和67.49%，其半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为140.75 ☒g/mL。其他组分海胆多肽的IC50在169.39～187.89 ☒g/mL之间。上述结果表明，分子质量对补体的抑制作用有一定影响，但对补体的抑制作用与多肽分子质量之间无明显相关性。

补体系统是人体重要的免疫防御系统之一，其非正常激活会引起人体免疫系统的过度反应从而造成人体自身的损伤［26］。补体活性异常增高与关节、肾脏、红细胞等损伤密切相关。天然存在的抗补体有多糖、黄酮类、甾体类、皂苷类及蛋白质等。关于多肽的抗补体作用研究并不多见。由于补体经典途径活性是从C1活化启动的，因此海胆多肽很有可能直接抑制C1的活化或抑制C1活化产物；此外，还有可能作用于C2、C3或C4，阻止这3个组分的活化。具体机制还有待今后深入研究。

2.6对细胞氧化损伤的保护作用

图5　海胆多肽对tBOOH致Chang肝细胞氧化损伤的直接保护作用Fig.5　Direct protection effect of sea urchin peptides against tBOOH-induced oxidation of Chang liver cells

图6　海胆多肽对tBOOH致Chang肝细胞氧化损伤的间接保护作用Fig.6　Indirect protection effect of sea urchin peptides against tBOOH-induced oxidation of Chang liver cells

海胆多肽的直接和间接抗氧化作用如图5、6所示。与空白组比较，tBOOH可导致Chang肝细胞发生明显氧化损伤。由图5可知，在加入tBOOH溶液的同时加入海胆多肽，海胆多肽对tBOOH所致氧化损伤具有直接保护作用，即海胆多肽的直接抗氧化作用。当多肽样品溶液终质量浓度为10 ☒g/mL时，1～3 kD和3～5 kD两组分的海胆多肽能够明显提高Chang肝细胞活力，具有显著的抗氧化活性。当终质量浓度提高至50 ☒g/mL时，所有多肽组分均显示出明显的抗氧化能力。其中，3～5 kD的多肽组分抗氧化活性相对较高。

先加入海胆多肽，使其与Chang肝细胞作用20 h后再加入tBOOH溶液，可显示海胆多肽对Chang肝细胞内在抗氧化能力的影响，结果如图6所示。5 个海胆多肽组分均显示出抵抗tBOOH氧化损伤的作用。但是，当质量浓度相同时，只有5～10 kD多肽组分在10 μg/mL时的抗氧化能力明显低于其他组分，总的来说不同多肽组分间的抗氧化活性无明显差异。

一般认为，多肽的分子质量大小与其活性有直接关系，低分子质量多肽通常具有更高的活性［27-28］。在本研究中，海胆多肽的直接抗氧化功能体现了低分子质量多肽的抗氧化作用优势，但在间接抗氧化作用中，这一特点并不突出，其原因有待于进一步研究。

3　结 论

采用木瓜蛋白酶制备了分子质量分布范围＜1、1～3、3～5、5～10 kD和＜10 kD的5 种海胆多肽组分多肽，在体外细胞实验水平检测了上述多肽的抑制肿瘤生长、淋巴细胞增殖及腹腔巨噬细胞吞噬功能调节、抗补体以及对氧化损伤Chang肝细胞的保护作用。总体来说，除了＜1 kD的多肽未表现出抑制肿瘤生长及促进腹腔巨噬细胞吞噬功能，1～3 kD多肽的抗补体活性明显强于其他组分多肽，所制备的海胆多肽均有一定调节功能，且不同分子质量分布范围的多肽间活性差异不明显。高翼［19］、刘纯慧［20，23］、张忠玲［21-22］及徐张展［24］等分别从蛋白、多糖和糖脂的角度证明了海胆免疫、抗肿瘤等多种生物学功能，为解释海胆多肽具有上述多种生物活性提供了有力解释和支持。与Qin Lei等［8］的研究有所不同，＜1 kD多肽的抗氧化活性并非最强，这种现象可能与所用抗氧化模型的不同有关。与海胆多糖、海胆蛋白相比，海胆多肽不但具有较强生物活性，分子质量小，更易吸收，而且加工过程几乎没有损失。另外，＜10 kD组分生物活性较强且稳定，将其作为海胆活性多肽产业化的主要形式，省去超滤加工环节，能显著降低生产成本。

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Preparation and Bioactivity of Peptides from Strongylocentrotus nudus

WANG Ting1，2， WANG Xiaohui3， MA Ying1，2， JI Xiaotong1，2， WANG Ling1，2， NIAN Yiying1，2， XUE Peng1，2，
MENG Shuang1， QIN Lei1，2， LI Dongmei1，2， ZHANG Gongliang1， HOU Hongman1， SUN Liming1，2，*（1. Food Science and Technology School， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， China； 2. National Engineering Research Center of Seafood， Dalian 116034， China； 3. Shandong Oriental Ocean Group Limited Company， Yantai 264003， China）

Strongylocentrotus nudus is one of the major species of economic sea urchin in China. It has high food and medicinal value due to its delicious taste and nutritional richness. In this work， bioactive peptides were prepared by enzymatic hydrolysis of Strongylocentrotus nudus gonads with papain and their bioactivities were investigated. Five fractions with molecular weight distribution of ＜ 1， 1-3， 3-5， 5-10 and ＜10 kD were obtained by ultrafiltration of the hydrolysate. Results showed that all the peptide fractions at a fi nal concentration of 200 ☒g/mL could promote lymphocyte growth. Moreover， at this concentration， all the peptides except the fraction of ＜ 1 kD could inhibit the growth of HeLa cells， and promote the phagocytic function of peritoneal macrophages. At 50 ☒g/mL， all the peptide fractions could protect Chang liver cells against oxidation induced by tert-butyl hydroperoxide； butylhydroperoxid through direct and indirect pathways. All the peptides could inhibit the classical complement pathway activity in a dose-dependent manner. All the above results suggested potential regulatory activity on cellular and humoral immune function and anti-oxidant capacity. The multiple bioactivities of these peptides deserve further investigation.

sea urchin； peptide； bioactivities； HeLa cell

10.7506/spkx1002-6630-201619040

S985；R151.3

A

1002-6630（2016）19-0237-06

王婷， 王晓慧， 马莹， 等. 光棘球海胆多肽的制备及其生物活性［J］. 食品科学， 2016， 37（19）： 237-242. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201619040. http：//www.spkx.net.cn

WANG Ting， WANG Xiaohui， MA Ying， et al. Preparation and bioactivity of peptides from Strongylocentrotus nudus［J］. Food Science，2016， 37（19）： 237-242. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619040. http：//www.spkx.net.cn

2016-04-08

辽宁省自然科学基金计划项目（2015020794）；辽宁省优秀人才项目（LJQ2012048）

王婷（1990—），女，硕士研究生，主要从事水产食品加工与活性物质研究。E-mail：254087063@qq.com

孙黎明（1974—），女，教授，博士，主要从事水产品加工、质量控制及活性物质研究。

E-mail：sunlm1974@163.com