对羟基苯甲醇对灰树花产胞外多糖的影响及其发酵动力学

朱俊杰，吴天祥，2，*，吴彩云，刘　昕，赵群丽

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省发酵与酿造重点实验室，贵州 贵阳 550025）

对羟基苯甲醇对灰树花产胞外多糖的影响及其发酵动力学

朱俊杰1，吴天祥1，2，*，吴彩云1，刘昕1，赵群丽1

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省发酵与酿造重点实验室，贵州 贵阳 550025）

通过向灰树花发酵液中添加不同质量浓度梯度的对羟基苯甲醇，分析其对灰树花菌体生长和胞外多糖合成的影响，并且进一步研究了添加对羟基苯甲醇后发酵液中菌丝体生长、残糖（还原糖）含量、胞外多糖产量、pH值、对羟基苯甲醇和天麻素含量的变化情况，并做动力学分析。结果表明：当对羟基苯甲醇添加量为200 mg/L时效果最佳，相比于空白组（未添加对羟基苯甲醇）使菌丝体生物量提高了22.73%，胞外多糖产量提高了10.24%，均显著高于空白组（P＜0.05）。动力学研究结果表明：在整个发酵过程中，灰树花生长从第8天趋于稳定，葡萄糖作为碳源不断被消耗并且胞外多糖逐渐合成，到第10天二者趋于稳定。此外，对羟基苯甲醇含量减少，部分转化为天麻素。

对羟基苯甲醇；灰树花；胞外多糖；生物量；发酵动力学

灰树花（Grifola frondosa），俗称“栗蘑”，又名贝叶多孔菌，属于担子菌亚门（Basidiomycotina），多孔菌科（Polyporaceae），是一种含丰富营养物质的药食两用真菌。其中灰树花多糖是其主要生物活性物质，具有抗肿瘤［1-2］、抗氧化［3-4］、抗艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）［5］、清除自由基［4］等生物活性。采用液体发酵培养来获得药用真菌多糖被认为是一种快速、高效、经济的方法。为了最大量获得真菌胞外多糖，很多研究在药用真菌液体发酵体系中添加一定的刺激物，来促进菌丝体生长和代谢产物合成［6-7］。Liu Gaoqiang等［8］发现通过添加乙酸乙酯到灵芝液体发酵培养基中可显著促进灵芝多糖的合成和菌丝体生长。Yang Hailong等［9］发现通过添加乙醇到灵芝液体发酵培养基中可显著促进灵芝多糖的合成和菌丝体生长。Tang Yajie等［10］同样也发现乳糖可以促进灵芝菌体生长和胞外多糖合成。而在灰树花液体发酵过程中，Hsieh等［11-12］添加植物油和橄榄油，Chen Huabing等［13］添加适量聚乙二醇，侯晓梅等［14］添加适量的白花蛇草、黄芪、连翘、薏苡仁等中药，赵亮等［15］添加苦荞、山药均可以促进灰树花细胞生长和胞外多糖的合成。此外，微生物能产生丰富的酶系可以用来发酵转化中药，Kim等［16］研究发现灰树花可以将牛蒡子苷转化为牛蒡子，朱红莉等［17］筛选到一株华根霉，可以转化对羟基苯甲醛合成天麻素，董亚晨等［18］利用黄绿蜜环菌将对羟基苯甲醇转化合成天麻素。

本课题组前期研究结果表明，在灰树花液体发酵体系中添加天麻提取物可显著促进灰树花细胞生长和胞外多糖的生物合成［19-23］。但是天麻本身是一种中药且价格昂贵。因此，本实验在灰树花发酵培养基中添加天麻素的前体物质对羟基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol），分析不同质量浓度的对羟基苯甲醇对灰树花发酵过程中菌体生长和胞外多糖合成的影响，并且动态分析了添加对羟基苯甲醇后发酵液中菌丝体生长、残糖（还原糖）含量、胞外多糖含量、pH值、对羟基苯甲醇含量的变化情况。此外还研究了是否存在对羟基苯甲醇转化合成天麻素，以更好地了解对羟基苯甲醇提高胞外多糖产量的机理。

1　材料与方法

1.1菌株、试剂与培养基

灰树花菌株（Grifola frondosa）51616，购自中国微生物菌种保藏管理中心。

天麻素、对羟基苯甲醇 美国Sigma公司；其余试剂均为市售分析纯。

斜面培养基：PDA培养基。

液体种子培养基：葡萄糖30 g/L、酵母膏6 g/L、蛋白胨2 g/L、MgSO4•7H2O 0.5 g/L、KH2PO40.5 g/L，pH值自然。

发酵培养基：葡萄糖50 g/L、酵母膏6 g/L、蛋白胨5 g/L、MgSO4•7H2O 2 g/L、KH2PO42 g/L，pH值自然。

1.2仪器与设备

BXM-30R立式灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TG2-16G低速离心机 上海安亭科学仪器厂；SW-CJ-1D净化工作台 苏州净化设备有限公司；1100高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪及检测器 美国Agilent公司。

1.3方法

1.3.1种子培养

1.3.1.1斜面种子培养

于母种试管中挑取黄豆粒大小的菌丝块接于PDA试管斜面中部，置于25 ℃恒温培养9 d。

1.3.1.2液体种子培养

先将斜面试管培养基上的菌丝用接种铲轻轻刮下，加入一定量的无菌水以使菌丝与固体培养基脱离，然后倒入250 mL三角锥形瓶液体种子培养基中，置于25 ℃、150 r/min恒温摇床、培养4～7 d。三角锥形瓶中应长出大量均匀细小的菌丝球且菌液澄清为最佳。

1.3.1.3发酵培养

在无菌条件下，按体积分数10%的接种量接种于发酵培养基中。250 mL三角锥形瓶装液量为100 mL、25 ℃、150 r/min摇床培养14 d。

1.3.2指标测定

1.3.2.1菌丝体生物量的测定

灰树花生长以其菌丝体生物量为指标。将发酵培养后的培养基进行过滤固液分离，得到菌丝体，菌丝体再用蒸馏水冲洗3 次，于数显鼓风干燥箱中60 ℃烘干至恒质量，称质量得菌丝体干质量，结果以单位体积发酵液中的菌丝体干质量为菌体生物量（g/L）。

1.3.2.2葡萄糖含量测定

采用3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定，取1 mL发酵液于50 mL容量瓶中并用蒸馏水定容，取定容后的1 mL稀释液于25 mL的比色管中，与1.5 mL DNS溶液混匀，在沸水中煮沸5 min定容至25 mL，于520 nm波长处测吸光度。

1.3.2.3胞外多糖含量测定

取上述滤液，加入4 倍体积95%乙醇，于4 ℃冰箱中静置24 h。然后离心（4 000 r/min，15 min），去除上清液，再用95%乙醇清洗沉淀3 次，最后将沉淀在60 ℃条件下烘干，再加蒸馏水溶解，用苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量。

1.3.3HPLC分析

取1 mL发酵液进行膜过滤（45 μm）用于HPLC检测，色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸水（流动相A）和乙腈（流动相C）。洗脱梯度：0～35 min，3%～30% C；35～45 min，30%～70% C。流速1 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL，检测波长221 nm。

1.4数据统计分析

由于模板投影位置与投影角度是一一对应关系，可以简单利用在角度对照表中搜索具有最小的相对误差归一化的欧氏距离值的项来确定具体的投影角度：

2　结果与分析

2.1对羟基苯甲醇添加量对灰树花生物量和胞外多糖合成的影响

图1　对羟基苯甲醇添加量对灰树花生物量和胞外多糖产量的影响Fig.1　Effect of p-hydroxybenzyl alcohol concentration on biomass and extracellular polysaccharide production by submerged culture of G. frondosa

在灰树花发酵液中添加不同质量浓度的对羟基苯甲醇，发酵8 d后菌丝体生物量和胞外多糖产量如图1所示。随着对羟基苯甲醇质量浓度的增加，灰树花菌丝生物量和胞外多糖产量均先增加至最大量后降低，这说明一定质量浓度的对羟基苯甲醇可能刺激灰树花菌丝体生长和胞外多糖的合成，尤其是能使合成多糖途径中一些相关酶活性的增强，例如葡萄糖基转移酶，从而使多糖合成增加，而质量浓度过高又可能会抑制菌丝体生长进而使胞外多糖产量有所降低。当对羟基苯甲醇质量浓度达到200 mg/L时，对灰树花菌丝生物量和胞外多糖合成具有明显促进作用（P＜0.05），分别达到最大值（2.365±0.05） g/L和（397.54±1.72） mg/L，与空白组（不加对羟基苯甲醇）相比，分别增加了22.73%和10.24%。基于后期研究，本课题组将进一步考察对羟基苯甲醇在灰树花发酵体系中的代谢及发酵动力学研究，选取对羟基苯甲醇添加量为200 mg/L作后期实验。

2.2发酵产物的HPLC检测

在灰树花发酵液中添加对羟基苯甲醇至质量浓度达到200 mg/L，取第0天和第8天的发酵液进行膜过滤（45 μm），然后用于HPLC进一步检测，结果如图2所示。发现第8天灰树花发酵液中对羟基苯甲醇含量减少，通过与标准品对照发现天麻素的吸收峰明显增加，这说明对羟基苯甲醇添加到灰树花发酵体系中可能不仅促进了菌丝生长及胞外多糖的合成，也有可能一部分自身被转化。接下来会继续跟踪考察对羟基苯甲醇在灰树花发酵体系中的代谢变化。

图2　对羟基苯甲醇转化产物的HPLC分析Fig.2　HPLC analysis of transformation product of p-hydroxybenzyl alcohol

2.3发酵动力学研究

在灰树花发酵液中添加对羟基苯甲醇至质量浓度200 mg/L进行发酵培养，每隔2 d取样，研究发酵过程中菌丝量、残糖（还原糖）、胞外多糖、对羟基苯甲醇、天麻素含量和pH值的变化。进一步揭示对羟基苯甲醇能促进灰树花菌丝体生长及胞外多糖的合成，也为获取灰树花菌丝体和胞外多糖的实际应用提供了参考依据。胞外多糖的积累与灰树花菌丝体的生长密切相关，菌丝体生长过程中消耗了大量的碳源，8 d后菌体生长进入稳定期，同时对羟基苯甲醇转化成天麻素也基本完成。这预示着实际生产过程中如果要连续培养，第8天是最佳的补料时间。

2.3.1菌体的生长动力学

图3　菌丝体生物量和残糖（葡萄糖）含量的动力学曲线Fig.3　Kinetic curves of biomass and reducing sugar （glucose）

2.3.2胞外多糖产量和pH值的动力学曲线

图4　胞外多糖产量和pH值的动力学曲线Fig.4　Kinetic curves of extracellular polysaccharide and pH

由图4可知，在灰树花整个发酵周期中，一开始合成胞外多糖较缓慢，当从第6天开始合成速率加快，第10天开始趋于平稳。最终第14天检测到灰树花胞外多糖产量达（402.23±13.76） mg/L。发现灰树花胞外多糖的合成稍微滞后于菌丝体的生长。而刚开始第0天能够检测到少量多糖，可能是因为培养基中酵母膏里的成分。此外发酵过程中pH值也是略微下降的，从4.64±0.02下降到3.56±0.05，可能的原因是随着灰树花的生长，能够利用碳源产生了少量的有机酸，当菌体生长进入稳定期时（第8天），发酵液的pH值变化也趋于平缓。

2.3.3对羟基苯甲醇和天麻素含量的动力学曲线

图5　对羟基苯甲醇和天麻素的动力学曲线Fig.5　Kinetic curves of p-hydroxybenzyl alcohol and gastrodin

由图5可知，在灰树花发酵培养基中添加对羟基苯甲醇，第4天之前对羟基苯甲醇和天麻素含量变化不明显。第4～6天时，对羟基苯甲醇含量迅速从（185.12±4.21） mg/L下降到（77.34±9.23） mg/L并最终转化完全，天麻素含量从（0.23±0.04） mg/L上升到（30.27±2.17） mg/L，但随着灰树花继续发酵又会略微减少。这现象可能是刚开始灰树花能够合成一些酶（如葡萄糖基转移酶将对羟基苯甲醇转化成天麻素），随着菌丝体生长，后期可能会吸收对羟基苯甲醇用以促进胞外多糖的合成并且有可能产生一些能使天麻素降解的酶。

3　结 论

目前提高灰树花菌丝体生长和多糖产量的研究主要集中在灰树花发酵培养基的优化及向培养基中添加适量的中药。这些传统的研究方法对提高灰树花菌丝量和胞外多糖产量是可行的，但本实验从另外的角度研究了对羟基苯甲醇对灰树花胞外多糖合成的影响。在灰树花发酵体系中，添加不同质量浓度的对羟基苯甲醇能在一定程度上促进灰树花菌体的生长和胞外多糖的合成，其中对羟基苯甲醇添加量为200 mg/L时对灰树花菌体生物量和胞外多糖合成的促进作用效果最明显，比空白组（未添加对羟基苯甲醇）分别提高了22.73%和10.24%。胞外多糖合成酶是菌体分泌的一种诱导胞外多糖产生的一类酶的总称。王琼［24］和张清丽［25］等的研究认为α-磷酸葡萄糖变位酶（α-phosphate glucose mutase，α-PGM）、磷酸葡萄糖异构酶、二磷酸尿苷-葡萄糖焦磷酸化酶、胸苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶等是胞外多糖合成的关键酶。Xu Xiaobao等［20］的研究表明通过添加中药天麻醇提物可以提高α-PGM活力，而天麻醇提物主要成分也包括对羟基苯甲醇和天麻素。本研究中对羟基苯甲醇对灰树花胞外多糖生物合成的促进作用可能与天麻醇提取物的作用一致，这一点需要作进一步研究。此外本研究重点进行了添加对羟基苯甲醇后灰树花发酵动力学研究，考察了发酵过程中菌丝体生物量、残糖（还原糖）含量、胞外多糖产量、pH值、对羟基苯甲醇和天麻素含量的变化。研究结果表明可以通过添加对羟基苯甲醇以及对培养条件进一步优化，缩短发酵时间，获得灰树花胞外多糖，更好地应用到中试和实际生产中。另外对于对羟基苯甲醇转化合成一种重要的中药活性物质——天麻素要做进一步研究。

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Effect of p-Hydroxybenzyl Alcohol on the Biosynthesis of Exopolysaccharide by Submerged Culture of Grifola frondosa and Fermentation Kinetics

ZHU Junjie1， WU Tianxiang1，2，*， WU Caiyun1， LIU Xin1， ZHAO Qunli1
（1. School of Liquor and Food Engineering， Guizhou University， Guiyang 550025， China；2. Key Laboratory of Fermentation and Brewing of Guizhou Province， Guiyang 550025， China）

The effect of adding different concentration gradients of p-hydroxybenzyl alcohol to the culture medium of Grifola frondosa on mycelial growth and the production of extracellular polysaccharide in submerged fermentation. Meanwhile， we determined changes in mycelial growth， reducing sugar （residual sugar） content， extracellular polysaccharide content， pH，p-hydroxybenzyl alcohol and gastrodin contents in the fermentation broth of Grifola frondosa， and we also made a dynamic analysis. Results showed that addition of 200 mg/L p-hydroxybenzyl alcohol was found to be optimal， resulting in an increase in mycelial biomass of 22.73% and an increase in extracellular polysaccharide production of 10.24% as compared with the control group without added p-hydroxybenzyl alcohol； both increases were signifi cant （P ＜ 0.05）. Dynamic analysis results showed that the growth of Grifola frondosa remained stable from day 8 onwards； glucose was consumed as the carbon source， and residual glucose and the production of extracellular polysaccharide both remained stable from day 10 onwards. In addition， the gastrodin content increased as a result of partial conversion of p-hydroxybenzyl alcohol into gastrodin.

p-hydroxybenzyl alcohol； Grifola frondosa； extracellular polysaccharide； biomass； fermentation kinetics

10.7506/spkx1002-6630-201619021

Q936

A

1002-6630（2016）19-0123-05

朱俊杰， 吴天祥， 吴彩云， 等. 对羟基苯甲醇对灰树花产胞外多糖的影响及其发酵动力学［J］. 食品科学， 2016， 37（19）: 123-127. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201619021. http://www.spkx.net.cn

ZHU Junjie， WU Tianxiang， WU Caiyun， et al. Effect of p-hydroxybenzyl alcohol on the biosynthesis of exopolysaccharide by submerged culture of Grifola frondosa and fermentation kinetics［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 123-127. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619021. http：//www.spkx.net.cn

2015-10-31

国家自然科学基金地区科学基金项目（［2014］31460537）

朱俊杰（1989—），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物。E-mail：15761621242@163.com

吴天祥（1965—），男，教授，博士，研究方向为发酵工程与生物转化。E-mail：ce.txwu@gzu.edu.cn