血清microRNA-17-5p在胆管癌患者中的表达及其临床意义

郭婧澜，谭蓓蓓，叶婷

（西南医科大学附属医院1.检验科，2.核医学科，四川 泸州 646000）

血清microRNA-17-5p在胆管癌患者中的表达及其临床意义

郭婧澜1，谭蓓蓓2，叶婷1

（西南医科大学附属医院1.检验科，2.核医学科，四川 泸州 646000）

目的探讨循环microR NA-17-5p（miR-17-5p）在胆管癌患者血清中的表达，以及在胆管癌诊断和预后方面的价值。方法利用实时荧光定量聚合酶链反应（qR T-PCR）检测79例胆管癌患者及健康对照血清标本中miR-17-5p的表达，并利用统计学方法分析循环miR-17-5p在胆管癌中的诊断和预后价值。结果qR T-PCR发现，循环miR-17-5p在胆管癌患者血清中的表达高于健康对照组；受试者工作特征曲线显示，循环miR-17-5p为胆管癌有效的诊断分子靶点；χ2检验结果表明，循环miR-17-5p与胆管癌患者的TNM分期呈正相关；卡普兰-迈耶生存曲线显示，循环miR-17-5p的表达水平与胆管癌患者术后5年总体生存率、无进展生存率呈负相关。结论循环miR-17-5p在胆管癌患者血清中表达水平显著增高，是胆管癌早期诊断和判断预后的潜在分子指标。

循环miR-17-5p；诊断；预后；胆管癌

胆管癌是起源于胆道内皮的恶性肿瘤，易发生早期淋巴转移和远处转移。胆管癌的发病率近年来呈逐年上升趋势，且其发病机制和易感因素尚未完全清楚[1]。根治性手术是目前唯一可能治愈胆管癌的治疗方法[2]。由于胆管癌缺少早期症状，当典型临床表现出现时，多数患者已处于进展期，而无法进行根治性手术[3-4]。另外，由于缺少高度敏感性和特异性的胆管癌早期诊断指标，胆管癌患者预后极差，通常只有几个月，多数因肿瘤发生转移而死亡[5]。在临床上通常使用糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）作为胆管癌诊断和判断预后的分子指标，但其敏感性和特异性均达不到理想水平，因此迫切需要寻找新的胆管癌早期诊断和判断预后的分子指标。

microRNA（miRNA）是一类广泛存在于真核生物体内的内源性的非编码小分子RNA[6]。研究发现，miRNA在包括胆管癌在内的大多数肿瘤中异常表达，可作为癌基因或抑癌基因发挥重要的作用，提示miRNA在肿瘤的基础研究和临床应用上具有广阔前景[7-8]。更为重要的是，肿瘤患者血清和血浆中miRNA表达谱的相关研究证实，循环miRNA可以稳定地被检测并提示肿瘤状态，是非常具有前景的肿瘤早期诊断和判断预后的分子指标[9-10]。然而，目前关于胆管癌患者血清中的循环miRNA的表达和临床价值方面的研究尚不足。本研究中，笔者检测循环miR-17-5p在79例胆管癌患者血清中的表达，并进一步分析其在早期诊断和判断预后方面的临床价值。

1 材料与方法

1.1一般资料

1.1.1研究对象选取2010年12月-2014年6月于西南医科大学附属医院就诊的胆管癌患者79例，以及同期健康对照患者79例，共158例。其中，行根治性手术治疗73例，姑息性手术治疗6例。所有入选患者的临床病理资料完整。纳入标准：①胆管癌患者经病理组织学确诊为胆管癌，且均为初诊、初治患者；②患者入组前未接受放、化疗；③入组患者无明显肝、肾功能异常；④未合并其他器官肿瘤或严重内科疾病。入组患者术前术后空腹采血各5ml，于真空干燥管中保存，1 500 r/min离心10 min后置入-80℃冰箱冷冻中保存待测。本研究经西南医科大学附属医院伦理委员会批准，所有入选的胆管癌患者同意使用其血清标本用于科学研究，并签署知情同意书。

1.1.2实验试剂和仪器miR-17-5p和内参U6引物购自北京TIANGEN科技有限公司，miRcute miRNA提取分离试剂盒购自北京TIANGEN科技有限公司，miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒购自北京TIANGEN科技有限公司，SYBR Fast qPCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。主要仪器：美国Bio-Rad CFX96荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪，中国海尔公司-80℃冰箱，中国海尔公司-20℃冰箱，德国Eppendorf公司台式低温高速离心机。

1.2实验方法

1.2.1循环miR-17-5p的提取及逆转录循环miR-17-5p提取方法参照北京TIANGEN科技有限公司的miRcute miRNA提取分离试剂盒所述步骤。紫外分光仪检测RNA浓度及纯度。逆转录步骤参照北京TIANGEN科技有限公司miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒所述步骤，每个逆转录体系中含有10 ng RNA模板。逆转录条件为：16℃变性30min，42℃退火30min，85℃延伸5min。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-timepolymerasechainreaction，qR T-PCR）qRT-PCR反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性12s，60℃退火35s，共循环40次。采用的相对定量法计算循环miR-17-5p的相对表达量，相对表达量=2-Δct，Δct=ctmiR-17-5p-ctU6，ct为每个反应管荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

1.2.3血清CA19-9含量检测使用瑞士罗氏公司的Cobas e 601电化学发光分析仪及配套CA19-9检测试剂盒，对胆管癌患者血清CA19-9进行检测，参考值为0～34u/ml。

1.3统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，胆管癌患者与健康对照、胆管癌患者术前与术后循环miR-17-5p表达差异比较用t检验，循环miR-17-5p表达与胆管癌患者临床病理特征之间的关系用χ2检验，循环miR-17-5p的诊断价值用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC），Kaplan-Meier法绘制生存曲线，各组间生存差异比较用Log-rankχ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1胆管癌患者血清循环miR-17-5p的表达

qRT-PCR结果显示，循环miR-17-5p在79例胆管癌患者血清中的相对表达量为（21.971± 13.134），79例健康对照组血清中miR-17-5p的相对表达量为（0.873±0.782），经t检验，差异有统计学意义（t=13.763，P=0.000）。miR-17-5p在胆管癌患者血清中相对表达量高于健康对照组。见图1。

图1　胆管癌患者血清miR-17-5p的表达水平

2.2胆管癌患者手术前后血清循环miR-17-5p的表达

qRT-PCR结果显示，在73例行根治性手术治疗的胆管癌患者中，术前miR-17-5p的相对表达量为（20.641±12.232），术后miR-17-5p的相对表达量为（4.516±4.458），经t检验，差异有统计学意义（t= 10.583，P=0.007），术后循环miR-17-5p的表达较术前降低。而在6例行姑息性手术治疗的胆管癌患者中，术前miR-17-5p的相对表达量为（28.572±21.603），术后miR-17-5p的相对表达量为（20.167±9.087），经t检验，差异无统计学意义（t=0.879，P=0.403），手术前后血清循环miR-17-5p的表达水平无明显改变。见图2。

图2　胆管癌患者手术前后血清miR-17-5p的表达变化

2.3循环miR-17-5p表达水平对胆管癌的诊断效率

根据79例胆管癌患者术前循环miR-17-5p和CA19-9的表达水平绘制ROC曲线，结果显示，miR-17-5P的ROC曲线下面积为0.855[95%置信区间（Confidenceinterval，CI）：0.795，0.915]，敏感性为81.051%，特异性为75.947%，对应诊断界值7.27，CA19-9的ROC曲线下面积为0.814（95%CI：0.747，0.880），敏感性为75.941%，特异性为71.931%。提示在胆管癌中循环miR-17-5p有较高的诊断价值。见图3。

图3　循环miR-17-5p和CA19-9对胆管癌的诊断价值

2.4循环miR-17-5p的表达与胆管癌患者临床病理特征的关系

miR-17-5p高表达的TNMⅠ、Ⅱ期胆管癌患者14例，miR-17-5p高表达的TNMⅢ、Ⅳ期胆管癌患者28例；miR-17-5p低表达的TNMⅠ、Ⅱ期胆管癌患者26例，miR-17-5p低表达的TNMⅢ、Ⅳ期胆管癌患者11例，经χ2检验，差异有统计学意义，循环miR-17-5p的表达上调与胆管癌患者的TNM分期相关，随着胆管癌TNM分期进展，循环miR-17-5p的表达亦逐渐升高。而循环miR-17-5p的表达与患者的年龄、性别、细胞核分化程度等临床病理特征无关。见附表。

2.5循环miR-17-5p与胆管癌患者术后5年生存率的关系

根据73例行根治性切除术的胆管癌患者术前循环miR-17-5p表达水平，将胆管癌患者分为循环miR-17-5p高表达组和循环miR-17-5p低表达组。卡普兰-迈耶生存曲线显示，循环miR-17-5p高表达组的胆管癌患者的术后5年总体生存率和无进展生存率均低于循环miR-17-5p低表达组（总体生存率log-rank test：P=0.012，无进展生存率log-rank test：P=0.023）。见图4。

附表　临床病理因素与胆管癌患者循环miR-17-5p表达水平的关系例

图4　循环miR-17-5p与胆管癌患者术后5年生存率的关系

3 讨论

既往文献显示，循环血液中的miR-17-5p可作为多种肿瘤的诊断和判断预后指标，包括肺癌、胃癌、胰腺癌和肝癌等[11-15]。笔者发现，胆管癌患者血清循环miR-17-5p为胆管癌早期诊断和判断预后的重要指标。本研究中，笔者检测循环miR-17-5p在胆管癌和健康对照血清中的表达水平，研究发现，循环miR-17-5p在胆管癌患者血清中表达较健康对照升高。而后笔者利用ROC曲线评估循环miR-17-5p作为胆管癌诊断指标的可行性，结果显示，根据胆管癌患者血清中循环miR-17-5p的表达水平可有效地区分出胆管癌患者，是胆管癌有效的诊断指标。另外，研究发现循环miR-17-5p与胆管癌患者TNM分期及术后5年总体和无进展生存率密切相关，结果显示，循环miR-17-5p的水平随着TNM分期升高而相应升高，循环miR-17-5p高表达的胆管癌患者术后5年总体生存率和无进展生存率均低于循环miR-17-5p低表达组，提示在胆管癌中，miR-17-5p可能起到癌基因的作用。

miR-17-5p是miR-17-92家族成员，在多种肿瘤中发挥癌基因的作用。miR-17-5p在多种肿瘤中表达异常升高，包括结肠癌、胃癌、肝细胞癌、和脑胶质瘤等[16-19]。另外，研究发现miR-17-5p在乳腺癌、肺癌及结肠癌中可调控肿瘤细胞的增殖和分化[20-22]。更为重要的是研究发现，miR-17-5p可抑制p21、BIM、AIB1和E2F1等抑癌基因的表达而促进肿瘤细胞增殖和分化[20，23-24]。在胆管癌的发生、发展中，miR-17-5p同样发挥着重要作用。研究显示，过表达miR-17-5p可上调YES1的表达，而进一步促进胆管癌细胞的增殖并抑制肿瘤细胞凋亡[25]。笔者认为，miR-17-5p在胆管癌的发生、发展中同样起到癌基因的作用。

综上所述，笔者的研究证实，胆管癌患者血清中miR-17-5p表达高于健康对照组；血清中miR-17-5p胆管癌早期诊断为有效的分子指标；胆管癌患者循环miR-17-5p的水平与胆管癌的TNM分期分呈正相关，而与年龄、肿瘤类型及分化程度等临床病理特征无关；血清中miR-17-5p高表达的胆管癌患者5年总体生存率和无进展生存率均低于循环miR-17-5p低表达组。本研究揭示循环miR-17-5p在胆管癌中的临床价值，为胆管癌的早期诊断及预后判断提供潜在分子靶点。

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（童颖丹编辑）

Expression of circulating miR-17-5p in cholangiocarcinoma patients and its clinical significance

Jing-lan Guo1，Bei-bei Tan2，Ting Ye1
（1.Clinical Laboratory；2.Department of Nuclear Medicine，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Objective To explore the expression of circulating miR-17-5p in the patients with cholangiocarcinoma and its clinical significance.Methods Expression of circulating miR-17-5p was analyzed by qRTPCR in 79 patients with cholangiocarcinoma.Statistical analysis was conducted to analyze the diagnostic and prognostic value of circulating miR-17-5p in cholangiocarcinoma.Results qRT-PCR revealed that the circulating miR-17-5p was significantly up-regulated in the serum of the patients with cholangiocarcinoma compared to the normal controls.ROC curves revealed that circulating miR-17-5p was a promising diagnostic biomarker for patients with cholangiocarcinoma.Chi-square test revealed that circulating miR-17-5p was positively associated with clinical stage of the patients with cholangiocarcinoma.Kaplan-Meier curves revealed that the cholangiocarcinoma patients with high circulating miR-17-5p expression had poorer outcome compared to the patients with low circulating miR-17-5p expression.Conclusions Circulating miR-17-5p expression is up-regulated in serum of patients with cholangiocarcinoma，and is a promising diagnostic and prognostic biomarker for patients with cholangiocarcinoma.

circulating miR-17-5p；diagnosis；prognosis；cholangiocarcinoma

R 735

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.009

1005-8982（2016）19-0042-05

2016-07-06