生物转化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的定量分析方法

张红蕾，徐志栋，李　玮,2*，杨瑜涛，杜　洁，韩孟楠，王烁康

(1.河北大学　化学与环境科学学院，河北　保定　071002；2.河北博伦特药业有限公司，河北　石家庄　052263)



生物转化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的定量分析方法

张红蕾1，徐志栋1，李玮1,2*，杨瑜涛1，杜洁1，韩孟楠1，王烁康1

(1.河北大学化学与环境科学学院，河北保定071002；2.河北博伦特药业有限公司，河北石家庄052263)

以芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)为柱前衍生剂，四硼酸钠为缓冲溶液，建立了一种柱前衍生反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定微生物转化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的定量分析方法。优化了衍生反应条件，当衍生反应体系中水和乙腈的比例为66∶34，pH值为9.9时衍生效果最佳。采用Agilent Extend C-18柱进行分离，以0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈作为流动相，梯度洗脱，检测波长263 nm。L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸均在0.01～5.00 mg/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限为5.00～7.00 ng/L，不同浓度下的平均回收率分别为98.9%～102%和97.9%～100%。该方法重现性好，精密度高，为定量分析微生物发酵液中的L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸提供了有效方法。

柱前衍生；反相高效液相色谱；反式-4-羟基-L-脯氨酸；L-脯氨酸；微生物转化

反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline，trans-Hyp)为亚氨基酸，是L-脯氨酸 (L-Pro) 羟基化后的产物，易于衍生，药理活性多样[1-2]，可用于新一代培南类抗生素[3]、抗肿瘤药[4]、抗高血压药[5]及新型胃药[6]等多种新创制药物的合成。由于具有抗氧化、抗辐射的作用，该物质在化妆品领域也有重要应用[7]。

目前，反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法主要有生物提取法和生物酶催化转化法[8-11]。生物提取法主要以动物胶原蛋白为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换树脂纯化等过程制备，此方法虽然技术成熟，但原料成本高，提取率低，“三废”排放量大、污染严重。生物酶催化法利用脯氨酸羟化酶的催化特性，以L-脯氨酸为原料通过发酵转化得到反式-4-羟基-L-脯氨酸。生物转化法与生物提取法相比反应条件温和，能耗低，污染小。本实验室曾筛选到一株可以生物转化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组大肠杆菌工程菌[12]。

在反式-4-羟基-L-脯氨酸的微生物转化及生产中，对其含量进行分析十分重要。目前，文献已报道的反式-4-羟基-L-脯氨酸的定量分析方法大部分采用氯胺T法[13]，该方法简便易操作，但检测浓度范围较窄，且只能对羟脯氨酸定量，无法反映脯氨酸的变化情况。高效液相色谱可解决这一问题，本文借鉴衍生试剂柱前衍生氨基酸的高效液相色谱分析方法[14-16]，利用芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)与样品进行衍生反应，对衍生体系中水和乙腈的比例进行了优化，并对衍生化样品的稳定性进行了考察。结果显示，该方法前处理简单、检测范围宽、重复性好、衍生产物稳定，为应用高效液相色谱分离及定量分析微生物转化体系中L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸提供了有效方法。

1　实验部分

1.1仪器与材料

Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Centrifuge 5424R离心机(德国Eppendorf公司)；ZWYR-200D振荡培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；Vortex-5旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；BT125D天平(德国Sartorius公司)。

L-脯氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、FMOC-Cl、十水合四硼酸钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；三氟乙酸(上海麦恪林生化科技有限公司)；乙腈、甲醇(安徽时联特种试剂有限公司)；LB培养基(生工生物工程股份有限公司)。实验用水均为去离子水。

1.2标准溶液的配制

精密称取L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸适量，用水配制成浓度为50.00 mg/mL 的标准溶液，分别将上述两种标准溶液用水梯度稀释至0.01,0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mg/mL。于4 ℃保存，备用。

1.3衍生化方法

1.3.1标准品衍生化 分别吸取“1.2”中不同浓度标准品溶液50 μL于1.5 mL EP管中,向每支EP管内分别加入200 μL 0.125 mol/L四硼酸钠水溶液、410 μL水、320 μL乙腈、20 μL FMOC-Cl的乙腈溶液(0.38 mol/L)，置于涡旋混匀器振荡5 s后静置10 min，过0.45 μm微孔滤膜后进行RP-HPLC检测。

1.3.2待测样品衍生化 重组大肠杆菌接种于含3.00 g/LL-脯氨酸的LB培养基中,于37 ℃恒温培养箱中培养48 h，将大肠杆菌发酵液以9 000 r/min离心2 min,取50 μL上清液加入1.5 mL离心管内，并加入0.125 mol/L四硼酸钠水溶液200 μL、水410 μL、乙腈320 μL、0.38 mol/L FMOC-Cl的乙腈溶液20 μL，置于涡旋混匀器振荡5 s后静置10 min，过0.45 μm微孔滤膜后进行RP-HPLC分析。

1.4RP-HPLC分析条件

色谱柱为Agilent Extend C-18(4.6 mm ×250 mm，5 μm，Agilent公司)，流动相A为0.1% 三氟乙酸水溶液,B为0.1% 三氟乙酸乙腈溶液，检测波长263 nm，进样量5 μL，梯度洗脱条件∶0～5 min，30% B；5～8 min，30%～40% B；8～15 min，40% B；15～20 min，40%～50% B；20～25 min，50% B；25～30 min，50%～90% B；30～38 min，90% B；38～41 min，90%～30% B；41～45 min，30% B。

1.5衍生化样品的稳定性测定

分别配制浓度为0.20，1.00，5.00 mg/mL 的L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸的标准品，进行衍生化处理后,再分别于4 ℃、室温(RT)和37 ℃放置20 h后取出进行液相色谱分析，以室温放置0 h的衍生化样品为对照。并采用RP-HPLC对4 ℃保存0，12，24，48，72 h的不同浓度衍生化样品的稳定性进行分析。

2　结果与讨论

2.1衍生条件优化

2.1.1衍生体系缓冲盐的选择 对衍生体系3种不同缓冲盐溶液进行考察。结果显示，以N-甲基吗啉盐酸盐(0.125 mol/L)作为缓冲盐时，L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸的衍生产物不出峰；以三乙胺(0.125 mol/L)作为缓冲盐时有目标峰，但相邻有杂峰干扰；以四硼酸钠(0.125 mol/L)作为缓冲盐时，不仅有呈高斯对称的目标峰，无杂峰干扰，且峰面积最大。综上所述，选择最佳缓冲盐为四硼酸钠。

2.1.2衍生体系水与乙腈比例的选择 对衍生体系中水与乙腈的不同比例进行了研究。在不同水和乙腈比例条件下，5.00 mg/mLL-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸标准溶液的衍生结果如表1所示，当水和乙腈的比例为98∶2和82∶18时有FMOC-Cl结晶析出，衍生产物的峰高较低；当水和乙腈的比例为50∶50和34∶66时有四硼酸钠结晶析出，且衍生产物的峰严重拖尾；当水和乙腈的比例为66∶34时，衍生产物无色透明，峰形呈高斯对称，且半峰宽较窄，无明显拖尾，故选择该比例下0.38 mol/L衍生剂用量20 μL。在该比例下缓冲体系的pH值为9.9，满足上述两种氨基酸易于在碱性环境中衍生的条件。

表1　不同比例的水和乙腈对衍生效果的影响Table 1　Effect of different proportions for water and acetonitrile on derivatization

2.1.3衍生反应时间的选择将5.00 mg/mLL-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸的衍生反应体系分别静置0，1，5，10，15，20 min后，采用RP-HPLC检测，发现随反应时间的延长，两种氨基酸的峰面积相应增加，当反应时间为10 min时，峰面积达到最大，反应时间继续延长，峰面积反而下降。故选择最优反应时间为10 min。

2.2线性范围、检出限与回收率

在“2.1”优化条件下，对不同浓度(0.01,0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mg/mL)的L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸标准溶液衍生后，采用高效液相色谱进行分析，每个浓度重复进样5次，以峰面积(y)为纵坐标，标准品浓度(x,mg/mL)为横坐标进行线性回归，L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸的线性方程分别为y=33.79x+0.983 0和y=38.86x+0.939 7，相关系数(r2)分别为0.999 9和0.999 8，线性范围均为0.01～5.00 mg/mL。当信噪比为4时，L-脯氨酸和L-羟脯氨酸的检出限分别为7.00 ng/L 和5.00 ng/L。重复测定不同浓度的标准溶液5次，L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸的平均回收率分别为98.9%～102%和97.9%～100%。

2.3精密度与重现性

将不同浓度(1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mg/mL)的L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸标准溶液按“1.3”方法处理后，进行RP-HPLC分析，每种浓度做5个平行，不同批次做3次重复。两种待测物3批次5次平行间的相对标准偏差(RSD)均小于3%，表明该方法的重现性良好。

2.4储存条件对衍生化样品稳定性的影响

分别对5.00 mg/mLL-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸衍生后样品的储存温度进行检测。经衍生化处理后，2种氨基酸衍生化样品分别于室温、37 ℃和4 ℃下放置20 h后进行RP-HPLC检测。结果显示，以室温放置0 h的衍生化样品为对照(CK)，发现衍生化样品于4 ℃储存时的稳定性最佳，与CK相比无显著差异。而室温放置20 h和37 ℃放置20 h的样品的稳定性较CK显著下降(P<0.05)，说明低温储存有利于衍生化样品的稳定。

此外，对不同浓度衍生化样品于4 ℃的储存时间(0，12，24，48，72 h)进行了检测。结果显示，不同浓度的L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸在不同保存时间下的峰面积无显著差异，说明衍生化处理的样品在4 ℃较为稳定，可以短时间(72 h)于4 ℃保存。

2.5微生物发酵体系中反式-4-羟基-L-脯氨酸的色谱分离及测定

图1　氨基酸标准品及发酵液样品的色谱图Fig.1　Chromatograms of amino acids standard and fermented liquid samplesa：L-Pro and trans-Hyp standard；b：L-Pro in LB mediun without inoculation of bacterium；c：co-culture with L-Pro biotransforming bacteriumwhich can bioconvert L-Pro into trans-Hyp

应用上述优化的柱前衍生方法检测重组大肠杆菌转化体系中L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。氨基酸标准品及发酵液样品的色谱图见图1，由图可见大肠杆菌发酵液中L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸获得了良好的分离，根据线性回归方程计算出剩余L-脯氨酸的浓度为0.64 mg/mL，转化生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的浓度为1.77 mg/mL，表明此时大肠杆菌转化L-脯氨酸为反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化率为 59.0%。

3　结　论

采用本文建立的柱前衍生反相高效液相色谱法可以准确、快速、灵敏地分离并检测重组大肠杆菌转化体系中的L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸含量，该方法适用于微生物转化体系中L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸的分离及定量分析。

[1]Remuzon P.Tetrahedron,1996,52(44):13803-13835.

[2]Seki M,Matsumoto K.Biosci.Biotechnol.Biochem.,1995,59:1161-1162.

[3]Wichmann C F,Liesch J M,Schwartz R E.J.Antibiot.,1989,42:168-173.

[4]DeFronzo R A.Diabetes,1988,37:667-687.

[5]Baker D H.AminoAcids,2009,37:29-41.

[6]Wu G,Bazer F W,Burghardt R C,Johnson G A,Kim S W,Knabe D A,Li P,Li X L,McKnight J R,Satterfield M C,Spencer T E.AminoAcids,2011,40:1053-1063.

[7]Zhang Z Q，Zhao D X，Yang X L.AminoAcidsandBioticResources(张自强，赵东旭，杨新林.氨基酸和生物资源)，2006，28：55-58.

[8]Kuttan R,Panikkar B,Binitha P P.Springerplus,2015,4:546.

[9]Yi Y,Sheng H,Li Z,Ye Q.BMCBiotechnol.,2014,14:44.

[10]Falcioni F,Blamk L M,Oliver F,Andreas K,Bruno B,Schmid A.Appl.Environ.Microbiol,2013,79:3091-3100.

[11]Falcioni F,Bühler B,Schmid A.Biotechnol.Bioeng.,2015,112:322-330.

[12]Hebei Brant Pharmaceutical Co.,Ltd.Hebei Normal University.China Patent (河北博伦特药业有限公司，河北师范大学.中国专利)，103275998A.2013-09-04.

[13]Takeshi S,Hideo M,Akio O.Biosci.Biotechnol.Biochem.,2000,64:746-750.

[14]Polly Chan S W,Greaves J,Da Silva N A,Wang S W.BMCBiotechnol.,2012,12:51.

[15]Tu C Y，Zhao J，Ge J L，Wu Y Q，Tang M H，Yuan Y J，Wei P，Li S C.J.Instrum.Anal.(屠春燕，赵珺，葛佳璐，吴燕娇，唐美华，袁艳娟，韦萍，李寿椿.分析测试学报)，2008，27(7)：681-685.

[16]Wei X L，Ding M F，Dong Y C，Yang D Z.ChinaFeed(魏秀莲，丁美方，董颖超，杨定忠.中国饲料)，2011，18：41-43.

Quantitative Analysis of trans-4-Hydroxy-L-proline by Microbial Conversion of L-Proline

ZHANG Hong-lei1,XU Zhi-dong1,LI Wei1，2*,YANG Yu-tao1,DU Jie1,HAN Meng-nan1,WANG Shuo-kang1

(1.College of Chemistry Environmental Science,Hebei University,Baoding071002,China;2.Heibei Brant Pharmaceutical Co.,Ltd.,Shijiazhuang052263,China)

trans-4-Hydroxy-L-proline is one of the valuable chiral building block in the production of many pharmaceuticals.A quantification method oftrans-4-hydroxy-L-proline andL-proline from microbial transformation by using reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) was developed.9-Fluorenylmethyl chloroformate(FMOC-Cl) was used as pre-column derivation agent,and the derivatization was proceeded in sodium tetraborate buffer solution(pH 9.9) containing acetonitrile-water(66∶34).The solution then was separated on an Agilent Extend C-18 column by using 0.1% trifluoroacetic acid and acetonitrile as mobile phase,and detected with UV detector at 263 nm.The linear ranges of two amino acid were in the range of 0.01-5.00 mg/mL,with correlation coefficients greater than 0.999.The limits of detection(LOD) were in the range of 5.00-7.00 ng/L,and the average recoveries oftrans-4-hydroxy-L-proline andL-proline were 98.9%-102% and 97.9%-100%,respectively.This method provides an effective way to quantifyL-proline andtrans-4-hydroxy-L-proline in microorganism fermented liquid system with good reproducibility,and high precision.

pre-column derivation; RP-HPLC;trans-4-hydroxy-L-proline;L-proline; microbial conversion

2016-02-16；

2016-04-05

2014年河北省高等学校高层次人才科学研究项目(GCC 2014013 )；国家国际科技合作专项项目(2013DFB30190)

李玮，博士，教授，研究方向：化学合成，Tel:0312-5929009，E-mail:13731461388@139.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.020

O657.72；O629.71

A

1004-4957(2016)09-1181-04