3种含氮杂环类药物的手性色谱拆分及其制剂中对映体含量的测定

全思思，陈　智，吴学昊，汤逊尤，淮文蓓，张　薇，叶连宝，范华均*

(1. 广东药科大学　药学院，广东　广州　510006；2. 广东药科大学　基础学院，广东　广州　510006)



3种含氮杂环类药物的手性色谱拆分及其制剂中对映体含量的测定

全思思1，陈智1，吴学昊1，汤逊尤1，淮文蓓1，张薇2，叶连宝1，范华均1*

(1. 广东药科大学药学院，广东广州510006；2. 广东药科大学基础学院，广东广州510006)

采用纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)手性固定相，利用反相高效液相色谱法研究了奥沙西泮、吡格列酮和罗格列酮3种含氮杂环类手性药物的色谱拆分行为。考察了流动相组成、pH值和柱温对3种药物对映体分离的影响，并对其拆分机理进行了探讨。结果表明，采用甲醇-水为流动相，通过添加醋酸或氨水调节pH值和控制柱温，可使3种药物的对映体得到完全分离(RS>1.5)，根据各自优化的色谱条件建立了这3种手性药物对映体的分析方法，并应用于其制剂的含量测定，方法简单、可靠。关键词：反相高效液相色谱法;含氮杂环类药物;纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯);手性固定相;手性色谱拆分

奥沙西泮、吡格列酮和罗格列酮均属于含氮杂环类药物，在临床上广泛使用。其结构中均含有1个手性碳原子，因而存在两种手性对映体(图1)。由于对映体之间存在明显的药理药效和毒副作用差异，而临床上因大量以外消旋体形式给药，常引起严重的不良反应[1]。如奥沙西泮常用作焦虑、失眠症、酒精戒断以及精神抑郁的辅助用药，但其S-对映体的活性比R-对映体高100～200倍[2];罗格列酮是治疗糖尿病的药物，其药理作用主要由S-对映体产生，其R-对映体不仅药效低，而且有较强的副作用[3-4];吡格列酮两个对映体在大鼠体内的药物动力学过程具有立体选择性[5]。近年来，手性色谱拆分方法迅速成为解决对映体分离和测定最有力的工具[6]，这对于手性药物拆分及其药理、毒副作用、代谢机制研究以及手性药物质量控制具有重要意义。在手性色谱法中以高效液相色谱(HPLC)应用最广，除了采用在流动相中添加手性拆分剂以外，利用各种手性固定相(CSP)是更简便、高效的拆分方法[6-7]。Aso等[8]用N-(叔丁胺基羰基)-L-缬氨酰胺基丙基硅胶手性柱，研究了奥沙西泮对映体在水溶液中消旋化的动力学行为;Vree等[9]用Chiral AGP蛋白质手性柱对奥沙西泮和替马西泮进行了拆分。Chuong等[10]用Cyclobond-I-2000 SP环糊精衍生物手性固定相测定了奥沙西泮口服给药后兔血浆中奥沙西泮对映体的浓度。近年来，以直连淀粉和纤维素为基质的多糖手性固定相基于其多碳手性中心常被用于手性药物的拆分[11]。Du[12]和高珊等[4]采用正相色谱(正己烷-异丙醇70∶30)在纤维素-3,5-二氯苯基氨基甲酸酯键合型手性柱上对吡格列酮或罗格列酮进行了拆分，均取得良好的分离效果。Jamali等[13]分别用HPLC和CE法在不同pH值下研究了吡格列酮和罗格列酮的拆分效果，其中采用纤维素三(4-甲基苯甲酸酯)(CTMB)手性固定相的拆分效果不理想。He等[14]采用CTMB手性固定相在正相条件下拆分了奥沙西泮对映体，但分析时间长，且不能完全分离。本文以甲醇-水为流动相，在反相色谱条件下研究了奥沙西泮、吡格列酮和罗格列酮3种含氮杂环类手性药物在CTMB 固定相上的手性色谱拆分行为，建立了这3种药物对映体的分析方法。结果表明，以甲醇-水为流动相，采用反相色谱法在CTMB手性固定相上可以拆分奥沙西泮、吡格列酮和罗格列酮的对映体，据此建立了测定这3种药物制剂对映体含量的分析方法，结果较为满意。

图1　奥沙西泮、吡格列酮及罗格列酮的化学结构式Fig.1　Chemical structures of oxazepam, pioglitazone and rosiglitazone

1　实验部分

1.1仪器与试剂

Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司);DL-360A超声清洗器(上海之信仪器有限公司);Shimadzu 2550 UV-Vis分光光度计。

奥沙西泮、盐酸吡格列酮、罗格列酮标准品(纯度≥98%，广州全奥化工产品有限公司);奥沙西泮片(北京益民药业有限公司);盐酸吡格列酮片(天津武田药品有限公司);罗格列酮钠片(太极集团重庆涪陵制药厂有限公司);无水乙醇、氨水(分析纯，广州化学试剂厂);甲醇(色谱纯，德国默克公司);冰醋酸(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司);实验用水为超纯水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

1.2试液的配制

分别精密称取一定量的奥沙西泮、盐酸吡格列酮、罗格列酮标准品，分别用甲醇超声溶解，并稀释、定容，配制成400 mg/L的标准溶液，使用时按需要逐级稀释。

1.3色谱条件

色谱柱：Phenomenon Lux 5 μ Cellulose-3(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相由0.01%氨水或醋酸(用冰醋酸或氨水调节pH值)与不同比例的甲醇组成，使用时过0.22 μm滤膜，采用恒组成等度洗脱;紫外检测器,奥沙西泮、盐酸吡格列酮、罗格列酮的检测波长分别为229，224，244 nm;流速1.0 mL/min;进样体积20 μL。

2　结果与讨论

2.1流动相组成对手性分离的影响

根据3种含氮杂环类手性药物的性质，以甲醇-水为基础溶剂，分别考察了不同比例的流动相组成对3种药物对映体分离的影响，结果见表1。实验结果表明，随着流动相中甲醇比例的降低，奥沙西泮、吡格列酮和罗格列酮对映体的保留能力和选择性提高，当甲醇-水的体积比分别50∶50，70∶30和70∶30时，可将3种手性药物的对映体完全拆分，其分离度Rs分别为2.02，2.67 和1.96。

表1　流动相组成对3种含氮杂环类药物对映体分离的影响Table 1　Effect of the composition of mobile phases on the separation of enantiomers for the three N-heterocyclic drugs

tR:retention time；Rs:resolution

2.2pH值对拆分的影响

对于含氮杂环化合物，由于N上的孤对电子易与H+发生作用，流动相pH值会影响其存在形式，因此在手性柱的pH值耐受范围内，按上述流动相组成以氨水和冰醋酸为介质考察了pH值(4.0，6.0，8.0)对3种手性药物对映体拆分的影响(图2)。由图2可知，随着pH值的变化，奥沙西泮、吡格列酮和罗格列酮表现出不同的色谱行为。奥沙西泮和罗格列酮的对映体在中性和弱酸性条件下更易分离，而吡格列酮对映体的分离度则随着pH值的减小而增大，但色谱峰更易拖尾，在pH 8.0时峰形最佳。这表明酸度控制在pH 6.0～8.0有利于3种含氮杂环化合物以合适的存在形式进行分离。

图2　pH值对奥沙西泮(A)、吡格列酮(B)、罗格列酮(C)对映体拆分的影响Fig.2　Effect of pH value on chiral separation of oxazepam(A), pioglitazone(B) and rosiglitazone(C)

2.3温度对手性分离的影响

在上述合适的流动相条件下，考察了柱温对奥沙西泮、吡格列酮和罗格列酮各对映体拆分的影响，结果显示，柱温对奥沙西泮、吡格列酮和罗格列酮对映体的拆分有较大影响。温度降低有利于提高奥沙西泮和吡格列酮的分离度，保留时间也随之增加，但色谱峰拖尾加剧;而罗格列酮的分离度则随着温度升高而增大，且保留时间缩短，色谱峰形更好。故选择奥沙西泮、盐酸吡格列酮和罗格列酮对映体的拆分柱温分别为25，30，40 ℃。

因此确定最佳色谱条件分别为：奥沙西泮：甲醇-0.01%醋酸溶液(50∶50，pH 6.0)，柱温25 ℃;吡格列酮：甲醇-0.01%氨水溶液(60∶40，pH 8.0)，柱温30 ℃;罗格列酮：甲醇-0.01%氨水溶液(65∶35，pH 8.0)，柱温40 ℃。在优化实验条件下，奥沙西泮、吡格列酮和罗格列酮对映体的拆分分离度均大于1.5(图3)，且峰形良好，能满足分析要求。

图3　奥沙西泮(A)、吡格列酮(B)和罗格列酮(C)对映体拆分的色谱图Fig.3　HPLC chromatograms of the enantiomeric separation of oxazepam(A), pioglitazone(B) and rosiglitazone(C)

2.4色谱拆分机理的探讨

色谱拆分结果表明，3种手性药物在CTMB上的色谱保留能力依次为罗格列酮>吡格列酮>奥沙西泮，拆分能力则依次为吡格列酮>罗格列酮>奥沙西泮，保留作用大小并不能决定手性拆分能力[15]，而是取决于手性环境以及与目标对映体的手性匹配作用。

根据“相互吸引-空间适应”机理[16]：CSP中的纤维素为D(+)-吡喃型葡萄糖单元的聚合物，拥有5n个手性中心，在葡萄糖2,3,6位上苯甲酸酯衍生化后使极性小的药物更易进入其手性环境[17];奥沙西泮、吡格列酮和罗格列酮含有羰基或羟基等质子给体或受体、电负性较大的N，O，S和Cl原子，以及含有富π电子的基团，易于发生氢键作用、偶极-偶极相互作用及π-π键相互作用[5, 18-21]。但温度对3种药物手性拆分的影响不同：与奥沙西泮和吡格列酮相反，升高温度(15～40 ℃)更易于罗格列酮在结构上p-π共轭，有利于对映体与CSP作用，从而提高分离度[22-23]。

2.5线性范围与检出限

分别取适量的奥沙西泮、盐酸吡格列酮和罗格列酮标准溶液，用甲醇稀释，各配制成一系列不同浓度的溶液，按优化的色谱条件进行测定，分别以峰面积(A)对质量浓度(ρ，μg/mL)绘制标准曲线，按信噪比S/N≈3和S/N≈10分别计算其检出限和定量下限(表2)。3种药物对映体在5.0 ～ 40.0 μg/mL范围内呈良好线性，相关系数(r2)均大于0.998。检出限为0.37～0.63 μg/mL；定量下限为1.18～2.03 μg/mL。

表2　3种含氮杂环类药物的线性范围、线性方程、检出限和定量下限Table 2　Linear range, regression equation, detection limit and quantitation limit of the three N-heterocyclic chiral drugs(n=3)

*A:peak area;ρ:mass concentration(μg/mL)

2.6实际样品的测定

分别取奥沙西泮、盐酸吡格列酮和罗格列酮钠片剂样品适量，经甲醇超声溶解后，取上层清液过滤，按其各自优化的色谱条件测定，并进行加标回收实验(见表3)。结果表明，上述3种手性药物对映体的加标回收率为94.6%～106.2%，相对标准偏差(RSD)为0.07%～1.0%，测得片剂外消旋体标示含量在101.4%～107.7%之间。

表3　3种含氮杂环类药物中对映体和消旋体含量的测定结果(n=3)Table 3　Quantitation of enantiomers andracematesfor the three N-heterocyclic chiral drugs (n=3)

3　结　论

本文采用纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)手性固定相系统地研究了流动相组成、pH值和柱温对奥沙西泮、吡格列酮和罗格列酮对映体分离的影响，探讨了其在CSP上的拆分机理。结果表明：以甲醇-水为流动相，通过氨水和醋酸调节pH值，在CSP上实现了各对映体的色谱拆分。利用优化的色谱条件可建立这3种含氮杂环手性药物对映体的测定方法，并成功应用于片剂中3种药物对映体含量测定，方法简便、可靠、准确。

[1] Lien A N，He H，Chuong P H.Int.J.Biomed.Sci.，2006，2(2):85-100.

[2] Möhler H，Okada T，Heitz P，Ulrich J.LifeSci.，1977，22:985-996.

[3] Parks D J，Tomkinson N C，Villeneuvem M S，Blanchard S G，Willson T M.Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998, 8(24):3657-3658.

[4]Gao S，Zhang C H，Yu L M.J.Instrum.Anal.(高珊，张春泓，于黎明. 分析测试学报)，2009，28(9)：1088-1091.

[5] Pang L.StudiesontheEnantiomericSeparationbyHPLCandPharmacokineticPropertiesofSeveralChiralDrugsintheRats.Zhengzhou：Zhengzhou University(庞丽. 几种手性药物的高效液相色谱法拆分及大鼠体内药动学研究.郑州：郑州大学)，2014.

[6] Zhang Z F.ApplicationandStudyoftheEnantioselectiveSeparationofChiralDrugsbyHPLC.Baoding:Hebei University(张哲峰.高效液相色谱法拆分药物对映体及其机理探讨.保定：河北大学)，2004.

[7] Ates H，Mangelings D，Heyden Y V.J.Chromatogr.B，2008，875(1):57-64.

[8] Aso Y，Yoshioka S，Shibazaki T，Uchiyama M.Chem.Pharm.Bull.，1988，36(5):1834-1840.

[9] Vree T B，Baars A M，Wuis E W.Pharm.Weekblad，1991，13(2):83-90.

[10]Chuong P H，Geraldine V P，He H，Nassima C C，Herve G，Marc T，Jean-Roger C，Jean-Michel W.J.Biochem.

Biophys.Methods，2002，54:287-299.

[11] Chankvetadze B，Kartozia I，Yamamoto C，Okamoto Y.J.Pharm.Biomed.Anal.，2002，27:467-478.

[12] Du B，Pang L，Yang Y H，Shen G P，Zhang Z Z.J.Chromatogr.B，2014，951/952(1):143-148.

[13] Jamali B，Bjoernsdottir I，Nordfang O，Hansen S H.J.Pharm.Biomed.Anal.，2008，46:82-87.

[14] He H，Liu Y，Sun C，Wang X R，Chuong P H.J.Chromatogr.Sci.，2004，42:62-66.

[15] Luo A，Wan Q，Fan H J，Chen Z，Wu X H，Huang X W，Zang L Q.Chin.J.Chromatogr.(罗安，万强，范华均，陈智，吴学昊，黄晓文，臧林泉.色谱)，2014，32(9):1013-1018.

[16] Wainer I W，Stiffin R M，Shibata T.J.Chromatogr.A，1987，411:139-151.

[17] Chankvetadze B.J.Chromatogr.A，2012，1269:26-51.

[18] Hiriyanna S G，Basavaiah K，Pati H N，Mishra B K.J.Liq.Chromatogr.Rel.Technol.，2007，30(20):3093-3105.

[19] Zhao J D，Di B，Feng F.Prog.Pharm.Sci.(赵敬丹，狄斌，冯芳.药学进展)，2008，32(10):447-453.

[20] Peng Q T，Hu W X，Tan S J.ActaPharm.Sin.(彭清涛，胡文祥，谭生建.药学学报)，1998，33(10):793-800.

[21] Lin B C.Chin.J.Chromatogr.(林炳承.色谱)，1990，6:363-367.

[22] Prikle W H，Pochapsky T C.Chem.Rev.，1989，89:347-362.

[23] Wang L P，Fan H J，Wu K H，Peng X S，Jiang Z T，Zang L Q.Chin.J.Chromatogr.(王李平，范华均，巫坤宏，彭晓升，江子滔，臧林泉.色谱)，2012，30(12):1265-1270.

Chiral Separation and Determination of Enantiomers of Three N-Heterocyclic Drugs in Tablets by Revered Phase High Performance Liquid Chromatography

QUAN Si-si1, CHEN Zhi1, WU Xue-hao1, TANG Xun-you1, HUAI Wen-bei1, ZHANG Wei2, YE Lian-bao1, FAN Hua-jun1*

(1. School of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou510006, China;2. School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou510006, China)

A novel method for the determination of enantiomers of three N-heterocyclic drugs was developed by revered phase high performance liquid chromatography using cellulose-tris-(4-methylbenzoate) as chiral stationary phase(CSP). Enantioseparation of oxazepam,pioglitazone and rosiglitazone on the CSP were performed by using mixture of methanol and water as mobile phase. Effects of methanol-water ratio,pH value and temperature on chiral separation of three drugs were investigated,respectively.The results showed that their enantiomers were separated on the CSP with methanol-0.01% acetic acid solution(50∶50) at 25 ℃ under pH 6.0 for oxazepam, methanol-0.01% ammonia solution(60∶40) at 30 ℃ under pH 8.0 for pioglitazone,and methanol-0.01% ammonia solution(65∶35) at 40 ℃ under pH 8.0 for rosiglitazone,respectively. The mechanism of racemic resolution for three drugs was discussed.The proposed method was successfully applied in the determination of three drugs enantiomers in commercial tablets,with recoveries and relative standard deviations(RSDs) of 94.6% -106.2% and 0.07%-1.0%,respectively.It was proved to be simple,reliable and accurate.

reversed phase high performance liquid chromatography(HPLC)；N-heterocyclic chiral drugs;cellulose-tris(4-methylbenzoate)；chiral stationary phase(CSP);enantioseparation

2016-02-26；

2016-03-29

广东省战略性新兴产业核心技术攻关计划资助项目(2012A080800012);广东省科技发展专项基金项目(2016A040403119)

范华均，博士，教授，研究方向：药物提取分离及药物分析，Tel：020-39352135，E-mail：junhuafan@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.017

O657.72;TQ460.72

A

1004-4957(2016)09-1167-05