10种植物精油对圣女果中三种致病菌抑制效果的研究

贺红宇,朱永清,王自鹏,刘　培,詹　敏,曾晓丹,*

(1.四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都 610066;2.四川省农业科学院,四川成都 610066)



10种植物精油对圣女果中三种致病菌抑制效果的研究

贺红宇1,朱永清1,王自鹏2,刘培1,詹敏1,曾晓丹1,*

(1.四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都 610066;2.四川省农业科学院,四川成都 610066)

通过研究植物精油对圣女果致病菌的抑制效果,筛选出对圣女果有良好贮藏保鲜效果的植物精油。使用不同浓度的10种植物精油,采用体外熏蒸法和直接接触法,筛选出对圣女果中三种致病菌具有较强抑制效果的精油,并研究其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果显示植物精油对三种致病菌的体外熏蒸法优于直接接触法;肉桂精油、山苍子精油、丁香精油、牛至精油对白地霉菌的最低抑菌浓度分别为0.05×104、0.1×104、0.5×104、0.5×104μL/L,最低杀菌浓度分别为0.05×104、0.1×104、0.5×104、1.0×104μL/L;肉桂精油、丁香精油、牛至精油对赤霉菌的最低抑菌浓度分别为0.05×104、0.2×104、0.2×104μL/L,最低杀菌浓度分别为0.05×104、0.2×104、0.5×104μL/L;肉桂精油、丁香精油、牛至精油、山苍子精油对毛霉菌的最低抑菌浓度分别为0.1×104、0.5×104、1.0×104、>1.0×104μL/L,最低杀菌浓度分别为0.1×104、0.5×104、>1.0×104、>1.0×104μL/L。肉桂精油、山苍子精油、丁香精油、牛至精油对白地霉菌均有较好抑制作用;肉桂精油、丁香精油、牛至精油对赤霉菌具有良好的抑菌及杀菌作用;肉桂精油、丁香精油对毛霉菌有较好抑制作用,牛至精油对毛霉菌有一定的抑菌作用,但杀菌效果不明显,山苍子精油对毛霉菌的抑菌杀菌效果最差。

圣女果,致病菌，植物精油,抑制效果,最低抑菌浓度,最低杀菌浓度

圣女果(Cherry Tomato,Lycopersicon esculentum var.cerasiforme)又称珍珠番茄、樱桃番茄、小番茄,内含糖、有机酸、矿物质和多种维生素等营养成分,尤其含人体必需的VC,含量是普通番茄的1.7倍,是难得的“水果蔬菜”,且是人类膳食中番茄红素的主要来源,深受人们的喜爱,同时因其具有延缓衰老、增强抵抗力、促进发育、抗癌、防癌等功效,被联合国粮农组织列为优先推广的“四大水果”之一[1-3]。

圣女果在我国许多地区已大量种植,其成熟果皮较薄,含水量高,且属于呼吸跃变型果实,自然采后在贮藏、运输和销售环节易受机械损伤、昆虫侵害、物理化学伤害及微生物侵染,容易腐烂变质。其中,微生物侵染中的真菌致腐是导致水果采后损失的一个重要因素,从保鲜的角度出发,控制真菌致腐的发生具有重要意义[4]。目前,圣女果的保鲜方法主要有化学试剂保鲜法、低温保藏法、气调保藏法、辐射保鲜法、涂膜保鲜法等[5-9]。然而,这些方法各有弊端:化学保鲜中的化学试剂因其致癌、致畸、毒性残留、环境污染和易引起病菌耐受等消极作用,使得应用越来越多地受到限制[10];低温贮藏能耗高,若操作不当还易导致果实冷害;气调贮藏投资较大,且对气体比例要求比较严格,稳定性差;辐射保鲜对辐射使用计量要求非常严格,操作难度较大;涂膜保鲜法所选用的成膜材料多为亲水性多糖或蛋白质类,使用该溶液进行涂膜常出现干燥时间长、易滋生微生物,且涂膜效果不稳定,易受环境温度、湿度的影响,难以形成均匀、稳定、持久的被膜。出于对食品安全的担忧,寻找来自自然界的天然保鲜剂是目前防治新鲜果蔬采后病害最有希望的方法之一。

本实验以天然植物精油为抑菌剂,通过研究其对自然腐烂圣女果中分离出的三株致病菌的体外抑菌能力,筛选出对圣女果贮藏保鲜有潜在效果的精油,为下一步以绿色、安全的方式开展圣女果保鲜工作提供一定的参考。

1　材料和方法

1.1材料与仪器

肉桂精油、茶树精油、薄荷精油、牛至精油、薰衣草精油、香茅精油、山苍子精油、佛手柑精油、丁香精油江西省红星化工有限公司；柠檬精油四川省安岳县绿海源科技开发有限公司;XFQ-1、XFQ-2、XFQ-3菌均由本实验室从自然腐烂的圣女果中分离纯化所得,经18S rDNA鉴定分别为白地霉菌(Galactomycescandidum)、赤霉菌(Gibberellasp. strain)、毛霉菌(Mucorfragilis);马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、氯化钠、无水乙醇、吐温-80等试剂均为分析纯。

JJ-CJ-1F超净工作台苏州市金净净化设备科技有限公司;LRHS-150-Ⅱ恒温恒湿培养箱上海跃进医疗器械;YXQ-LS-50SII立式压刀蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司医疗设备厂;CP214电子天平奥豪斯仪器上海有限公司。

1.2实验方法

1.2.1精油对病原菌的体外熏蒸处理实验参考冯武的滤纸片法[11]。用无菌打孔器在长有真菌(培养6 d)的平板上取直径为5 mm的菌块放入新制的PDA平板中央。将平板倒置,取直径为5 mm的无菌滤纸片放在平板盖中央,用移液器分别吸取1、2、3、4、5 μL精油于滤纸片上,重复6次,以滤纸片上不加精油的平板为对照,迅速用保鲜膜密封,于27 ℃培养7 d后观察结果,用十字交叉法测量菌落生长直径,通过以下公式计算出抑制率。

抑制率(%)=(C-T)/C×100

其中:C:对照菌落直径(cm);T:不同浓度条件下菌落直径(cm)。

1.2.2精油对病原菌的直接接触抑制实验参考徐龙的方法[12]。将一定体积的精油加入到已灭菌的PDA培养基(冷却至50 ℃左右)中,使精油终浓度分别为100、200、300、400、500 μL/L,摇匀后倒入培养皿,每皿20 mL。用无菌打孔器取直径为5 mm的病原菌菌块接入平板中央,以不添加精油的培养基为对照。重复6次,保鲜膜密封后置于27 ℃温度下培养7 d,用十字交叉法测量菌落生长直径,并计算抑菌率。抑菌率计算公式同1.2.1。

1.2.3精油最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定在无菌条件下,培养皿中加入14 mL的PDA培养基,再吸取1 mL浓度分别为15×104、7.5×104、3×104、1.5×104、0.75×104μL/L的精油(通过1.2.1和1.2.2筛选出具有抑菌效果的精油),以不添加精油的培养基为对照,摇匀,重复6次。编号后吸取待测菌种的悬浮液100 μL(控制浓度为105～106CFU/mL)于培养基表面,涂布均匀,置于27 ℃下培养5 d,观察有无菌落生长,若有记为阳性(+),表明该种精油无抑制作用;若无记为阴性(-),以完全没有菌生长的最低浓度作为该精油的MIC[13]。将完全没有菌生长的平皿用无菌打孔器取直径为5 mm的饼转接至空白PDA平板上,培养4 d若仍不长菌,则为MBC[14]。

1.3数据处理

数据分析和处理利用Microsoft Excel 2007实现。

2　结果与分析

2.110种植物精油的抑菌性

2.1.110种精油对XFQ-1菌的抑菌效果研究10种植物精油对XFQ-1菌的体外熏蒸抑制效果和直接接触抑制效果见表1和表2。结果显示,各种精油对XFQ-1菌均有不同程度的抑制效果,且随着精油浓度的增加,其抑制率也逐渐增加;此外,大多数精油表现出体外熏蒸抑菌效果好于直接接触法抑菌效果。由表1熏蒸处理结果可知,在1 μL低浓度熏蒸下,抑制效果较好的精油有肉桂精油、牛至精油、山苍子精油,其抑制率均达95%以上,其次为香茅精油,抑制率达60%以上;从表2直接接触处理结果可知,肉桂精油和山苍子精油具有较强的抑制作用,在低浓度下抑制率均达90%以上,其次为香茅精油和牛至精油,在低浓度下抑制率达50%以上。

表1　10种植物精油对XFQ-1菌的体外熏蒸处理效果

表2　10种植物精油对XFQ-1菌的直接接触抑制效果

综合两种处理方式的结果,可选择肉桂精油、牛至精油、山苍子精油、香茅精油继续进行MIC和MBC的实验。

2.1.210种植物精油对XFQ-2菌的抑菌效果研究10种植物精油对XFQ-2菌的体外熏蒸抑制效果和直接接触抑制效果见表3和表4。结果显示,熏蒸处理效果好于直接接触处理。在体外熏蒸实验中,只有肉桂精油、茶树精油、牛至精油、山苍子精油、佛手柑精油和丁香精油对XFQ-2菌有抑制作用,但在3 μL低浓度熏蒸下,表现出有较强抑制效果的精油只有肉桂精油、茶树精油、牛至精油和丁香精油,抑制率均达50%以上。在直接接触抑菌实验中,只有肉桂精油、牛至精油、山苍子精油和丁香精油对XFQ-2菌有抑制作用,且表现出较强抑制效果的有肉桂精油、牛至精油和丁香精油;而在设定的浓度内,无论是体外熏蒸处理还是直接接触处理,薄荷精油、薰衣草精油、香茅精油、柠檬精油均无抑菌作用。

表3　10种植物精油对XFQ-2菌的体外熏蒸处理效果

表4　10种植物精油对XFQ-2菌的直接接触抑制效果

综合两种处理方式的结果,可选择肉桂精油、牛至精油、丁香精油进行进一步的MIC和MBC实验。

2.1.310种植物精油对XFQ-3菌的抑菌效果10种植物精油对XFQ-3菌的体外熏蒸抑制效果和直接接触抑制效果见表5和表6。结果显示,各种精油对XFQ-3菌均有不同程度的抑制效果,且抑制率随着精油浓度的增加而增大;此外,精油体外熏蒸效果好于直接接触法。由表5熏蒸处理结果可知,在1 μL低浓度条件下熏蒸,抑制效果较好的精油有肉桂精油、牛至精油、香茅精油、山苍子精油、佛手柑精油、丁香精油,抑制率均达88%以上,其次为茶树精油,抑制率达70%以上。从表6直接接触处理结果可知,肉桂精油、牛至精油、丁香精油具有较强的抑制作用,在精油浓度300 μL/L时,XFQ-3菌完全被抑制;其次为山苍子精油,其抑制率达80%。

因此,综合两种处理方式的结果,可选择肉桂精油、牛至精油、山苍子精油、丁香精油继续进行MIC和MBC的实验。

表5　10种植物精油对XFQ-3菌的体外熏蒸处理效果

表6　10种植物精油对XFQ-3菌的直接接触抑制效果

2.2植物精油的MIC和MBC

2.2.14种植物精油对XFQ-1菌的MIC和MBC经10种植物精油对XFQ-1菌的抑菌性评价,选用肉桂精油、牛至精油、山苍子精油、丁香精油进行最低抑菌浓度实验,结果见表7。肉桂精油对XFQ-1菌的抑制效果最好,在各浓度下,培养5 d,均未见菌生长,可完全抑菌,其最低抑菌浓度为0.05×104μL/L;山苍子精油效果其次,在浓度大于0.1×104μL/L时,培养5 d,不见菌生长,由此可知,其最低抑菌浓度为0.1×104μL/L;牛至精油和丁香精油抑制效果最差,在浓度低于0.5×104μL/L培养5 d时,菌落能正常生长,因此,牛至精油和丁香精油的最低抑菌浓度均为0.5×104μL/L。

将完全没有菌生长的菌饼转接至新的PDA平板上,在27 ℃条件下继续培养4 d,观察其是否长菌,结果如表8。从肉桂精油平板上取下的菌饼在PDA培养基中均没有长菌,由此可见,肉桂精油对XFQ-1菌有很好的杀菌效果,其最低杀菌浓度为0.05×104μL/L;从山苍子精油和丁香精油平板上取下的菌饼在PDA培养基中也没有菌生长,可见山苍子精油和丁香精油对XFQ-1菌的最低杀菌浓度分别为0.1×104、0.5×104μL/L;浓度为0.5×104μL/L的牛至精油平板上的菌饼,转接至新的PDA培养基中,4 d后长菌,因此牛至精油对XFQ-1菌的最低杀菌浓度为1.0×104μL/L。

表7　植物精油对XFQ-1菌的最低抑菌浓度

注:“+”表示长菌,“-”表示未长菌,表8～表12同。

表8　植物精油对XFQ-1菌的最低杀菌浓度

2.2.23种植物精油对XFQ-2菌的MIC和MBC经3种植物精油对XFQ-2菌的抑菌性评价,选用肉桂精油、牛至精油、丁香精油进行最低抑菌浓度实验,结果见表9。肉桂精油对XFQ-2菌的抑制效果最好,在各浓度下,培养5 d,均不见菌生长,可完全抑菌,其MIC为0.05×104μL/L;牛至精油和丁香精油效果次之,在培养5 d时,浓度低于0.2×104μL/L的培养基中均有菌落生长,因此,牛至精油和丁香精油的MIC均为0.2×104μL/L。

表9　植物精油对XFQ-2菌的最低抑菌浓度

将完全没有菌生长的菌饼转接至新的PDA平板上,在27 ℃条件下继续培养4 d,观察是否长菌,结果如表10所示。从肉桂精油平板上取下的菌饼在PDA培养基中均未见菌生长,由此可见,肉桂精油对XFQ-2菌具有较好的杀菌效果,其MBC为0.05×104μL/L;从丁香精油平板上取下的菌饼在PDA培养基中也没有菌生长,可见其MBC为0.2×104μL/L;浓度为0.2×104μL/L的牛至精油平板上的菌饼,转接至新的PDA培养基中,4 d后长菌,因此牛至精油对XFQ-2菌的MBC为0.5×104μL/L。

表10　植物精油对XFQ-2菌的最低杀菌浓度

2.2.34种植物精油对XFQ-3菌的MIC和MBC经10种植物精油对XFQ-3菌的抑菌性评价,选用肉桂精油、牛至精油、山苍子精油、丁香精油进行最低抑菌浓度实验,结果见表11。肉桂精油对XFQ-3菌的抑制效果较好,在浓度大于0.1×104μL/L时,培养5 d,均没有菌生长,其MIC为0.1×104μL/L;丁香精油效果其次,在浓度大于0.5×104μL/L时,培养5 d,未见菌生长,因此,其MIC为0.5×104μL/L;牛至精油对XFQ-3菌具有一定的抑制效果,在培养5 d时,浓度低于1.0×104μL/L的培养基中均有菌落生长,由此可知,牛至精油的MIC为1.0×104μL/L;山苍子精油的抑菌效果最差,在各精油浓度下均长菌,可见其MIC大于1.0×104μL/L。

表11　植物精油对XFQ-3菌的最低抑菌浓度

将完全没有菌生长的菌饼转接至新的PDA平板上,在27 ℃条件下继续培养4 d,观察是否长菌,结果如表12所示。从肉桂精油平板上取下的菌饼在PDA培养基中均未见菌生长,可见肉桂精油对XFQ-3菌具有较好的杀菌效果,其MBC为0.1×104μL/L;丁香精油对XFQ-3菌具有一定的杀菌效果,当精油浓度高于0.5×104μL/L时,XFQ-3菌未生长,因此,丁香精油对XFQ-3菌的MBC为0.5×104μL/L;牛至精油和山苍子精油对XFQ-3菌的杀菌能力较差,取出的菌饼在PDA培养基上均长菌,由此可知,其MBC大于1.0×104μL/L。

表12　植物精油对XFQ-3菌的最低杀菌浓度

3　结论

不同精油对圣女果3种病原真菌的抑菌杀菌效果不同,且相同精油对不同病原真菌的抑菌能力也存在差异。对于白地霉菌(XFQ-1),肉桂精油的抑菌杀菌能力最强,其MIC和MBC均为0.05×104μL/L;山苍子精油次之,MIC和MBC均为0.1×104μL/L;牛至精油抑菌杀菌效果最差,其MIC为0.5×104μL/L,MBC为1.0×104μL/L。对于赤霉菌(XFQ-2),肉桂精油的抑菌杀菌效果最好,MIC和MBC均为0.05×104μL/L;丁香精油次之,MIC和MBC均为0.2×104μL/L;牛至精油抑菌能力和丁香精油相当,MIC为0.2×104μL/L,但杀菌能力最差,MBC为0.5×104μL/L。对于毛霉菌(XFQ-3),肉桂精油的MIC和MBC均为0.1×104μL/L,有较强的抑菌杀菌能力;丁香精油效果一般,其MIC和MBC均为0.5×104μL/L,牛至精油的抑菌能力较差,MIC为1.0×104μL/L,MBC大于1.0×104μL/L;山苍子精油的抑菌杀菌能力最差,其MIC和MBC均大于1.0×104μL/L。

实验得到不同精油在不同浓度下对三种病原菌的抑制效果,初步确定了不同精油对三种病原菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度,但应用到圣女果鲜果上的具体效果还有待进一步研究。

[1]宋姝婧,王晓拓,王志东,等. 5种植物精油对樱桃番茄常温保鲜效果的影响[J]. 核农学报,2015,29(5):932-939.

[2]胡亚云,傅虹飞,蔻莉萍. 模拟超市销售期间圣女果质构特性变化的研究[J]. 食品工业科技,2012,33(4):383-386.

[3]任邦来,靳文生. 赤霉素对番茄保鲜效果的影响[J]. 中国食物与营养,2012,18(4):22-25.

[4]EI-Ghaoth A,Wilson C L. Biologically-based technologies for the control of postharvest diseases[J]. Postharvest News and Information,1995,6(1):5-11.

[5]高海生,赵希艳,李润丰. 果蔬采后处理与贮藏保鲜技术研究进展[J]. 农业工程学报,2007,23(2):273-278.

[6]沈奇,金春雁,缪月秋,等. 丹皮酚磺酸钠对樱桃番茄的保鲜作用的研究[J]. 食品科学,2005,26(4):256-259.

[7]魏岩梅,陈晓燕.圣女果气调保鲜包装技术研究[J]. 中国包装工业,2005(12):58-60.

[8]陈浩,高鹏,高雅,等. 辐照降解壳聚糖涂膜对沙糖桔、圣女果和金桔的保鲜作用[J]. 核农学报,2008,22(5):640-644.

[9]李亚娜,李瑞勇. 壳聚糖涂膜对圣女果的保鲜性能研究[J]. 包装与食品机械,2011,29(3):9-12.

[10]Dianez F,Santos M,Blanco R,et al. Fungicide resistance in Botrytiscinema isolates from strawberry crops in Huelva southwestern Spain[J]. Phytoparasitica,2002,30(5):529-534.

[11]冯武. 植物精油对果蔬采后病害的防治及其防治机理研究[D]. 杭州:浙江大学,2006(6):17-18.

[12]徐龙. 精油抑制黑莓采后病原真菌及保持果实品质的研究[D]. 杭州:浙江师范大学,2014:19-20.

[13]孙静思,陈季武,王帮正,等. 三种芳香植物抑菌比较及GC/MS分析[J]. 食品工业科技,2011(11):151-155.

[14]段雪娟,吴克刚,柴向华. 香辛料精油成分对生鲜食品中有害菌杀灭活性研究[J]. 林产化学与工业,2012(3):87-91.

Inhibitory effects of ten plant essential oils on three pathogens of cherry tomatoes

HE Hong-yu1,ZHU Yong-qing1,WANG Zi-peng2,LIU Pei1,ZHAN Min1,ZENG Xiao-dan1,*

(1.Institute of Agro-Products Processing Science and Technology,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China;2.Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China)

The aim of the study was to investigate inhibitory effects of plant essential oil on pathogens in the cherry tomatoes . In addition,the plant essential oil that had good fresh-keeping effect was selected. In this study,the fumigation method and direct contact method were used to select the essential oils which had inhibitory effects on three pathogens of cherry tomatoes. Moreover,the minimal inhibitory concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration(MBC)of essential oils were determined. The minimal inhibitory concentrations of cinnamon essential oil,litsea cubeba oil,clove essential oil and oregano essential oil againstGalactomycescandidumwere 0.05×104,0.1×104,0.5×104μL/L and 0.5×104μL/L respectively. The minimum bactericidal concentration were 0.05×104,0.1×104,0.5×104μL/L and 1.0×104μL/L respectively. The minimal inhibitory concentrations of cinnamon essential oil,clove essential oil and oregano essential oil againstGibberellasp. strain were 0.05×104,0.2×104μL/L and 0.2×104μL/L respectively. The minimum bactericidal concentration were 0.05×104,0.2×104μL/L and 0.5×104μL/L respectively. The minimal inhibitory concentrations of cinnamon essential oil,clove essential oil,oregano essential oil and litsea cubeba oil againstMucorfragiliswere 0.1×104,0.5×104,1.0×104μL/L and greater than 1.0×104μL/L respectively. The minimum bactericidal concentration were 0.1×104,0.5×104μL/L,greater than 1.0×104μL/L,greater than 1.0×104μL/L respectively. Cinnamon essential oil,litsea cubeba oil,clove essential oil and oregano essential oil had good inhibitory effect againstGalactomycescandidum. Cinnamon essential oil,clove essential oil and oregano essential oil had high inhibitory activity againstGibberellasp. strain. Cinnamon essential oil and clove essential oil had good inhibitory effect againstMucorfragilis,butoregano essential oil had not obvious inhibitory effect and litsea cubeba oil had little inhibitory effect againstMucorfragilis.

cherry tomato;pathogenic bacteria;essential oil;inhibitory effect;minimal inhibitory concentration;minimum bactericidal concentration

2016-02-22

贺红宇(1987-)，女，硕士，助理研究员，主要从事果蔬保鲜与采后生理方面的研究，E-mail:hehongyu2010@163.com。

曾晓丹(1981-)，男，副研究员，主要从事果蔬贮藏保鲜与包装方面的研究，E-mail:zxd_saas@aliyun.com。

成都市科技惠民技术研发项目(2015-HM01-00250-SF)；四川省财政创新能力提升工程(2014CXSF-039)；四川省财政创新能力提升工程(2016GXTZ-009)。

TS255.3

A

1002-0306(2016)18-0153-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.021