响应面法优化可食性鸡蛋清蛋白膜的酶法改性工艺

郑　优,贾　亮,段　蓉,马莹莹

(西南大学荣昌校区,重庆 402460)



响应面法优化可食性鸡蛋清蛋白膜的酶法改性工艺

郑优,贾亮,段蓉,马莹莹

(西南大学荣昌校区,重庆 402460)

采用响应面分析法(RSM)对可食性鸡蛋清蛋白膜的酶法改性工艺进行优化。以谷氨酰胺转移酶(TG-B)浓度、pH、注模前酶作用时间及干燥温度为单因素,对膜的机械性能(拉伸强度、断裂伸长率)和阻隔性能(水蒸气透过系数、透油系数)进行测定,得出各指标的二次回归模型。结果表明,TG-B酶浓度0.13%、pH8.34、注模前酶作用时间45 min、干燥温度20 ℃时膜的各项性能最佳。该工艺参数下膜各性能指标分别为:拉伸强度(5.225±0.108) MPa、断裂伸长率70.492%±3.172%、水蒸气透过系数(3.405±0.067) g·mm/(m2·d·kPa)、透油系数(0.812±0.007) g·mm/(m2·d)。

鸡蛋清蛋白,谷氨酰胺转移酶,可食膜

以可食性天然高分子物质(如多糖[1]、脂质、蛋白质[2]、纤维素等)为基材的可食性包装材料逐渐成为绿色包装材料的研究热点。可食、可生物降解,还可作为某些功能性成分(如抗褐变剂[3]、防腐剂[4-5]、抑菌剂[6]等)载体的可食性膜(edible films),通常需添加增塑剂、交联剂、增强剂等成膜助剂,并通过一定的成膜工序形成。可食性膜是具有一定机械强度和阻隔性能的薄膜,在食品涂膜保鲜方面的应用较多。鸡蛋清蛋白具有很高的营养价值,含有8种必需氨基酸[7]。国内外研究人员已对它的部分功能特性作了研究[8-9],如鸡蛋清蛋白的起泡性、溶解性等,但对其成膜性能的研究较少。

与塑料薄膜相比,可食性蛋白膜具有低机械强度、高透水性的不足,限制了其在食品包装行业的应用,其机械和阻隔性能还需进行改良。对蛋白质分子进行改性处理[10-12]是改善膜性能的方法之一,目前已有部分学者尝试了酶法改性在可食性膜制备中的应用[13-14]。本文以鸡蛋清蛋白为原料,探讨酶法改性工艺(谷氨酰胺转移酶浓度、pH、注模前酶作用时间及干燥温度)对膜性能的影响,以期获得最佳酶改性工艺,为可食性鸡蛋清蛋白膜的化学改性提供基础参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

鸡蛋清粉(BR级,蛋白质含量80%)成都西亚化工股份有限公司;谷氨酰胺转移酶(TG-B)泰兴市一鸣精细化工有限公司;其他化学试剂均为市售分析纯试剂。

CH-1-B手持式测厚仪(0.001 mm) 济南兰光机电技术有限公司;90-2型定时恒温磁力搅拌器金坛市科欣仪器有限公司;XYW(L)-100N智能电子拉力测试机济南兰光机电发展有限公司;DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司;PB-10 Sartorius精密pH计德国赛多利斯公司;KQ5200DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;S-3000N型扫描电镜HITACHI公司;E-1010型喷金机HITACHI公司。

1.2实验方法

1.2.1可食性鸡蛋清蛋白膜的制备

1.2.1.1工艺流程膜液→磁力搅拌(30 min)→调节pH→60 ℃水浴加热搅拌→加入一定量TG-B酶→磁力搅拌一定时间→过滤→脱气→塑料板流延成膜→干燥→揭膜→贮存→待测。

1.2.1.2膜液配方100 mL蒸馏水中,鸡蛋清蛋白8 g,增塑剂甘油/聚乙二醇400(3/1)3 g,交联剂环氧氯丙烷0.71 g,增强剂羧甲基纤维素钠0.55 g。

1.2.1.3操作要点磁力搅拌前应使膜液的添加物基本溶解,水浴加热搅拌时应维持一定的搅拌方向,流延成膜时应流延均匀。

1.2.2单因素实验设计

1.2.2.1TG-B酶浓度对膜性能的影响固定反应pH为7.0,注模前酶作用时间为15 min,干燥温度为40 ℃,研究不同TG-B酶浓度(0、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%)对膜性能的影响。

1.2.2.2pH对膜性能的影响固定TG-B酶浓度为0.12%,注模前酶作用时间为15 min,干燥温度为40 ℃,研究不同反应pH(6、7、8、9、10)对膜性能的影响。

1.2.2.3注模前酶作用时间对膜性能的影响固定TG-B酶浓度为0.12%,反应pH为8,干燥温度为40 ℃,研究不同注模前酶作用时间(5、15、30、45、60 min)对膜性能的影响。

1.2.2.4干燥温度对膜性能的影响固定TG-B酶浓度0.12%、反应pH8和注模前酶作用时间30 min,研究不同干燥温度(20、30、40、50、60 ℃)对膜性能的影响。

1.2.3响应面实验设计在单因素实验的基础上,利用响应面分析Design-Expert软件,制定4因素3水平的Box-Behnken实验设计,并对各个指标进行工艺优化。因素水平表为表1。

表1　响应面实验设计因素水平表

1.2.4指标测定

1.2.4.1膜厚的测定用测厚仪在膜上随机取3点测定,结果以平均值±标准差表示,单位为mm。

1.2.4.2机械性能的测定参照GB/T13022-91的规定,用电子拉力机测定,采用II型试样模具裁切膜样,设定膜的初始夹距为80 mm,实验拉伸速度为50 mm/min。通过以下公式得出膜的拉伸强度和断裂伸长率[15]:

式(1)

式(2)

式(1)中,TS为拉伸强度(MPa);F为膜所受的最大拉力(N);S为膜的横截面积(m2);式(2)中,E为断裂伸长率(%);L0为膜的原始长度(mm);ΔL为膜断裂时增加的长度(mm)。

1.2.4.3水蒸气透过系数的测定参照GB1037-88的方法,用拟杯子法测定[16],通过下式计算水蒸气透过系数。

式(3)

式(3)中,WVP为水蒸气透过系数,g·mm/(m2·d·kPa);Δm为时间t内水蒸气透过量(g);d为膜厚(mm);A为试样面积(m2);t为测试时间(d),本实验为2 d;ΔP为试样两侧水蒸气压差(kPa)。

1.2.4.4透油系数(PO)的测定于试管中装5 mL色拉油,用圆形的待测膜封住试管口,倒置在事先称好质量的滤纸上,在密闭环境中放置2 d,记录滤纸的质量变化[17]。

1.2.5扫描电镜观察按照1.2.1所述的制膜工艺将对照(未改性)膜和最优酶法改性工艺条件下的膜制备好,并保证充分干燥,然后取(2×2)mm2的膜固定在不锈钢样品台上,放入试样表面处理机中,在真空状态下进行表面镀金处理20 min,厚度约10 μm,取出样品台。将样品台放入S-3000N型扫描电子显微镜中抽真空20 min后,进行扫描观察。

1.2.6数据统计与分析利用Design-Expert7.0软件对响应面实验结果进行方差分析(p<0.05)。

2　结果与讨论

2.1单因素实验结果

2.1.1TG-B酶浓度对可食性鸡蛋清蛋白膜性能的影响由图1和图2可以看出,随着TG-B酶浓度的增大,膜的拉伸强度呈上升趋势,而膜的断裂伸长率、水蒸气透过系数和透油系数均呈下降趋势。当TG-B酶浓度为0～0.12%时,膜的拉伸强度显著上升,并在0.12%处达最大值4.350 MPa,比对照组提高了21.51%,膜的断裂伸长率显著下降,膜的水蒸气透过系数和透油系数亦显著下降,并在0.12%处分别达最小值3.840 g·mm/(m2·d·kPa)和0.951 g·mm/(m2·d),分别比对照组下降了21.47%和21.60%;当TG-B酶浓度为0.12%～0.20%时,膜的拉伸强度和断裂伸长率均显著下降,而水蒸气透过系数和透油系数则稍有上升。综合考虑各个因素,较适的TG-B酶浓度为0.12%。

图1　TG-B酶浓度对膜机械性能的影响Fig.1　Effect of TG-B enzyme concentration on mechanical properties of film

图2　TG-B酶浓度对膜阻隔性能的影响Fig.2　Effect of TG-B enzyme concentration on barrier properties of film

2.1.2pH对可食性鸡蛋清蛋白膜性能的影响结果如图3和图4所示。

图3　pH对膜机械性能的影响Fig.3　Effect of pH values on mechanical properties of film

图4　pH对膜阻隔性能的影响Fig.4　Effect of pH values on barrier properties of film

由于pH为6.0时较接近于鸡蛋清蛋白的等电点(4.3～4.6),大量蛋白质产生聚沉,因而无法成膜。由图3和图4可看出,当pH从7.0变化至10.0时,膜的拉伸强度先上升后下降,且各处理组间差异显著,在pH为8.0时达最大值4.530 MPa,这可能是因为pH为8.0时TG-B酶的活性较高,且此时鸡蛋清蛋白的溶解性能较好。随着pH的增大,膜的水蒸气透过系数和透油系数均呈下降趋势,但各个处理组间的差异不显著,其中透油系数在pH为8.0时达最小值0.867 g·mm/(m2·d)。虽然随着pH的增大膜的断裂伸长率显著上升,但在pH9.0～10.0时TG-B酶的活性较低,膜的拉伸强度出现下降的情况,且膜表面有细微颗粒,膜颜色偏黄、碱味较重。综合考虑膜的各项性能,选择pH8.0为最适pH。

2.1.3注模前酶作用时间对可食性鸡蛋清蛋白膜性能的影响结果如图5和6所示。

图5　注模前酶作用时间对膜机械性能的影响Fig.5　Effect of enzyme reaction time on mechanical properties of film

图6　注模前酶作用时间对膜阻隔性能的影响Fig.6　Effect of enzyme reaction time on barrier properties of film

由图5和图6可以看出,当注模前酶作用时间为5～30 min时,膜的拉伸强度和断裂伸长率均显著增大;当注模前酶作用时间为30～60 min时,膜的拉伸强度和断裂伸长率的上升趋势放缓甚至稍有下降。随着注模前酶作用时间的延长,膜的水蒸气透过系数和透油系数持续降低,但二者的下降趋势亦在30 min处放缓。综合考虑膜的各项性能和实验的效率,选定30 min为最佳的注模前酶作用时间。

表2　Box-Benhnken实验设计及结果

图7　干燥温度对膜机械性能的影响Fig.7　Effect of drying temperature on mechanical properties of film

图8　干燥温度对膜阻隔性能的影响Fig.8　Effect of drying temperature on barrier properties of film

2.1.4干燥温度对可食性鸡蛋清蛋白膜性能的影响由图7和图8可以看出,随着干燥温度的上升,膜的拉伸强度和断裂伸长率均显著下降,而膜的水蒸气透过系数和透油系数先缓慢下降后显著上升。这可能是因为较低温度下TG-B酶具有较高的稳定性,能使蛋白质分子间产生持久的共价交联,有利于膜网络结构的形成。从图7和图8亦可以看出,20～30 ℃下干燥的膜的机械性能和阻隔性能明显高于其他温度下干燥所得的膜,这也说明了TG-B酶在低活性下长时间改性能显著提高蛋白膜的性能。综合考虑各方面的因素,选择20～30 ℃为最佳的干燥温度。

表3　TG-B酶改性工艺对可食膜性能影响的最佳拟合方程表

2.2响应面实验结果及分析

2.2.1响应面实验设计及结果实验结果见表2。

2.2.2拟合方程方差分析由表3可以看出,四个响应值的回归模型均极显著(p<0.001),且四个模型的失拟检验p>0.05,这表明四个模型失拟不显著,能较好地描述实验结果。四个回归模型的决定系数R2分别为0.9609、0.9291、0.9654、0.9926,这表明该模型的拟合度较好,分别能够解释96.09%、92.91%、96.54%、99.26%响应值的变化,因此可用这些回归模型代替真实实验点对实验结果进行分析。同时,这四个模型均具有较低的离散系数(CV=1.7%、3.22%、3.3%、0.71%),说明整个实验具有较好的精确度和可靠性。

2.2.3响应面分析膜各性能指标的回归方程系数及显著性分析见表4。

表4　各性能指标的回归方程系数及显著性分析

注:**表示差异极显著,p<0.01;*表示差异显著,p<0.05。

由表4可看出,TG-B酶浓度和干燥温度是影响膜拉伸强度的主要因素,实验因素X1和X3、X1和X4的交互作用显著,它们的响应面分别为图9和图10。以图10为例,当干燥温度一定时,膜拉伸强度随TG-B酶浓度的增大不断增大,表现为响应面曲线较陡;当固定TG-B酶浓度时,膜拉伸强度随干燥温度的增大变化较平缓。从图10可看出响应面存在极大值。

图9　TG-B酶浓度、注模前酶作用时间对膜拉伸强度的影响Fig.9　Effect of TG-B enzyme concentration and enzyme reaction time on TS

图10　TG-B酶浓度、干燥温度对膜拉伸强度的影响Fig.10　Effect of TG-B enzyme concentration and drying temperature on TS

从表4可以看出,pH和注模前酶作用时间是影响膜断裂伸长率的主要因素,实验因素X2和X3、X2和X4的交互作用显著,它们的响应面分别为图11和图12。以图11为例,当pH一定时,膜断裂伸长率随注模前酶作用时间的增加不断上升;当固定注模前酶作用时间时,膜断裂伸长率随pH的增大不断增大。响应面在pH在8.5～9.0,注模前酶作用时间为39～45 min时存在极值,二者有明显的交互作用。

图11　pH、注模前酶作用时间对膜断裂伸长率的影响Fig.11　Effect of pH and enzyme reaction time on E

图12　pH、干燥温度对膜断裂伸长率的影响Fig.12　Effect of pH and drying temperature on E

从表4可看出,TG-B酶浓度和pH均是影响膜水蒸气透过系数和透油系数的主要因素,交互项X1X2对膜水蒸气透过系数和透油系数的影响显著,它们的响应面分别为图13和图14。TG-B酶浓度对膜水蒸气透过系数的影响不大,pH对响应值的影响较大;而TG-B酶浓度对膜透油系数的影响较大,pH对响应值的影响不大。响应面在TG-B酶浓度0.08%～0.10%、pH7.0～7.5时的坡面极陡,且响应面存在极小值,两者的交互作用显著。

图13　TG-B酶浓度、pH对水蒸气透过系数的影响Fig.13　Effect of TG-B enzyme concentration and pH on WVP

图14　TG-B酶浓度、pH对透油系数的影响Fig.14　Effect of TG-B enzyme concentration and pH on PO

2.2.4酶法改性工艺的优化与验证采用Design-Expert软件,对4个二次回归方程进行联合求解,得最佳的酶法改性工艺为:TG-B酶浓度0.13%、pH8.34、注模前酶作用时间45 min、干燥温度20 ℃,此时可食性鸡蛋清蛋白膜各性能指标的理论预测值分别为5.33 MPa、71.79%、3.224 g·mm/(m2·d·kPa)、0.783 g·mm/(m2·d)。在最佳酶法改性工艺下进行验证实验,得出各性能指标的验证值分别为:(5.225±0.108) MPa、70.492%±3.172%、(3.405±0.067)g·mm/(m2·d·kPa)、(0.812±0.007) g·mm/(m2·d),与预测值基本接近,表明上述回归模型具有良好的拟合性和可靠性。

2.2.5扫描电镜分析未改性和最佳酶法改性工艺下制备的膜的表面电镜图如图15、图16所示。

图15　未改性膜的表面电镜图(1000×)Fig.15　The surface electron micrograph(1000×)of unmodified film

图16　酶法改性膜的表面电镜图(1000×)Fig.16　The surface electron micrograph(1000×)of enzyme modified film

由图15可知,未改性处理制得的膜表面结构出现了较明显的凹凸不平,并具有较多的孔洞和褶皱,均匀性较差,因而膜表面外观较差,机械性能和阻隔性能不佳。由图16可知,膜液经酶法改性处理后制得的膜表面结构较光滑平整,结构较均匀致密,无明显的孔隙或褶皱,膜外观较好。

3　结论

3.1通过响应面分析法建立了可食性鸡蛋清蛋白膜4个性能指标(拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过系数、透油系数)的二次回归模型,各回归模型均显著,拟合度良好。其中,TG-B酶浓度和干燥温度是影响膜拉伸强度的主要因素;pH和注模前酶作用时间是影响膜断裂伸长率的主要因素;TG-B酶浓度和pH均是影响膜水蒸气透过系数和透油系数的主要因素。

3.2可食性鸡蛋清蛋白膜的酶法改性工艺的最佳条件为TG-B酶浓度0.13%、pH8.34、注模前酶作用时间45 min、干燥温度20 ℃。在此条件下各性能的理论值为5.33 MPa、71.79%、3.224 g·mm/(m2·d·kPa)、0.783 g·mm/(m2·d),验证值为:(5.225±0.108) MPa、70.492%±3.172%、(3.405±0.067) g·mm/(m2·d·kPa)、(0.812±0.007) g·mm/(m2·d),与理论值接近,具有良好的预测性,优化结果可靠。

[1]Ma Qiumin,Zhang Yue,Critzer F,et al. Physical,mechanical,and antimicrobial properties of chitosan films with microemulsions of cinnamon bark oil and soybean oil[J]. Food Hydrocolloids,2016(52):533-542.

[2]Rubilar J F,Zúiga R N,Osorio F,et al. Physical properties of emulsion-based hydroxypropyl methylcellulose/whey protein isolate(HPMC/WPI)edible films[J]. Carbohydrate Polymes,2015(123):27-38.

[3]Robles-s ánchez R M,Rojas-graü M A,Odriozola-serrano I,et al. Influence of alginate-based edible coating as carrier of antibrowning agents on bioactive compounds and antioxidant activity in fresh-cut Kent mangoes[J]. LWT-Food Science and Technology,2013(50):240-246.

[4]Jouki M,Mortazavi S A,Yazdi F T,et al. Use of quince seed mucilage edible films containing natural preservatives to enhance physico-chemical quality of rainbow trout fillets during cold storage[J]. Food Science and Human Wellness,2014(3):65-72.

[5]Ollé R C P,Jagus R J,Gerschenson L N,et al. Effect of natamycin,nisin and glycerol on the physicochemical properties,roughness and hydrophobicity of tapioca starch edible films[J]. Materials Science and Engineering C,2014(40):281-287.

[6]Ramos ó L,Silva S I,Soares J C,et al. Features and performance of edible films,obtained from whey protein isolate formulated with antimicrobial compounds[J]. Food Research

International,2012(45):351-361.

[7]杨万根,王璋,徐玉娟,等. 蛋清利用研究进展[J]. 食品科学,2009,30(23):456-459.

[8]Mohammadi NAFCHI A,Tabatabaei R H,Pashania B,et al. Effects of ascorbic acid and sugars on solubility,thermal,and mechanical properties of egg white protein gels[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2013,62(12):397-404.

[9]Song H P,Kim B,Choe J H,et al. Improvement of foaming ability of egg white product by irradiation and its application[J]. Radiation Physics and Chemistry,2009(78):217-221.

[10]Weng Wuyin,Zheng Huibin. Effect of transglutaminase on properties of tilapia scale gelatin films incorporated with soy protein isolate[J]. Food Chemistry,2015(169):255-260.

[11]García M A,Pérez L,De Le Pez N,et al. Effect of molecular weight reduction by gamma irradiation on chitosan film properties[J]. Materials Science and Engineering C,2015(55):174-180.

[12]Rodriguez-turienzo L,Cobos A,Diaz O,et al. Effects of microbial transglutaminase added edible coatings based on heated or ultrasound-treated whey proteins in physical and chemical parameters of frozen Atlantic salmon(Salmo salar)[J]. Journal of Food Engineering,2013(119):433-438.

[13]Giosafatto C V L,Di Pierro P,Gunning P,et al. Characterization of Citrus pectin edible films containing transglutaminase-modified phaseolin[J]. Carbohydrate Polymers,2014(106):200-208.

[14]Mariniello L,Giosafatto C V L,Dipierro P,et al. Use of the enzyme transglutaminase to prepare hydrocolloid-based edible films suitable for the food industry[J]. Journal of Biotechnology,2008(136):290-304.

[15]轻工业部塑料加工应用科学研究所. GB/T 13022-1991 塑料-薄膜拉伸性能实验方法[S]. 北京:中国标准出版社,1991.

[16]汪学荣,周玲,阚建全,等. 超声波处理海藻酸钠膜液对膜性能的影响[J]. 食品工业科技,2010,31(5):308-310.

[17]汪学荣,阚建全,汪水平,等. 可食性大豆分离蛋白膜的制膜工艺研究[J]. 食品科学,2008,29(5):153-158.

Optimization of enzymatic modification conditions of albumin edible film by response surface methodology

ZHENG You,JIA Liang,DUAN Rong,MA Ying-ying

(Rongchang Campus,Southwest University,Chongqing 402460,China)

The enzymatic modification conditions of albumin edible film were optimized through response surface methodology. With TG-B enzyme concentration,pH value,enzyme reaction time,drying temperature being response factors,the tensile strength,elongation,water vapor permeability and oil permeability of edible film were measured and the quadratic regression models of indicators were achieved. The results showed that the optimal enzymatic modification conditions were TG-B enzyme concentration 0.13%,pH value 8.34,enzyme reaction time 45 min and drying temperature 20 ℃. Under this condition,the properties of edible films were tensile strength(5.225±0.108) MPa,tensile strength 70.492%±3.172%,water vapor permeability(3.405±0.067) g·mm/(m2·d·kPa),oil permeability(0.812±0.007) g·mm/(m2·d).

egg albumin;tranglutaminase;edible film

2016-03-11

郑优(1989-)，女，硕士，实验师，研究方向：畜产品加工及贮藏，E-mail：zhengyou1989@163.com。

中央高校基本业务费专项资金资助(XDJK2016C054);西南大学荣昌校区科研启动基金(20700209);西南大学荣昌校区青年基金项目(20700438)。

TS206.4

A

1002-0306(2016)18-0317-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.052