用BTB快速鉴定黄连木雌雄株方法初探

杨鹭生，李国平

（1.武夷学院教务处，福建武夷山354300；2.武夷学院生态与资源工程学院，福建武夷山354300）

用BTB快速鉴定黄连木雌雄株方法初探

杨鹭生1，李国平2

（1.武夷学院教务处，福建武夷山354300；2.武夷学院生态与资源工程学院，福建武夷山354300）

用溴麝香草酚兰（BTB）的方法，对黄连木雌雄株进行鉴别。结果表明，黄连木雌株提取液在加入溴麝香草酚兰（BTB）溶液3 h后，溶液颜色由黄绿色转变为褐色，而雄株提取液的颜色还是保持原来的黄绿色，随着时间的增加，雌株提取液褐变加深，雄株无明显变化。说明用BTB溶液鉴定黄连木雌雄株，实验现象明显，认为可用此方法对黄连木幼苗的性别进行初步鉴定。本实验对黄连木幼苗雌雄株的鉴定提供了科学依据。

黄连木；BTB溶液；颜色变化；性别鉴定

黄连木（Pistacia chinesis）为漆树科植物，原产中国，生态适应性极强，分布非常广，是重要的荒山、荒滩造林树种，是优质的用材树种；同时黄连木叶繁茂而秀丽，树冠开阔，秋天叶子颜色变成深红色或橙黄色，故也是一种重要的木本观叶植物。黄连木是雌雄异株植物，其种子富含油脂，含油量达40%左右，用种子油脂生产的生物柴油碳链长度集中在（C17～C19）之间，与普通柴油接近［1］，是一种极具开发前景的木本生物质能源树种。黄连木生产上主要以果实和种子为收获对象，雄株只能作为授粉树，栽培的经济效益较低，黄连木造林中更需要大量的雌株，因此对黄连木苗木的性别鉴定尤其是早期鉴定显得尤为重要，对科学搭配雌雄株比例、提高栽培效益具有重要意义。

植物性别鉴定的研究，概括为形态学、生理生化、细胞学和分子生物学等几个方面［2-3］。形态学比较简单易行，但多数雌雄异株植物在幼苗期未表现出外部形态差异；细胞学是进行雌雄株性别鉴定的重要方法之一，分子生物学技术是最近几年来发展起来的鉴定植物雌雄株性别的新技术、新方法，具有相对准确的特点，但对于实验设备要求较高。理生化指标用于雌雄株幼苗的鉴定，相对于形态学鉴定较为复杂，但结果较为可靠，不失为一种切实可行的雌雄株性别鉴定方法。许多研究结果表明，植物外部性状的表现是体内生理生化代谢的结果，依据个体在生理生化代谢上的某些差异可以达到早期鉴别性别的目的［4-6］。

溴麝香草酚蓝（BTB）是一种酸碱指示剂。张雪明、龙程等人用溴麝香草酚蓝法（简称BTB法）成功地对黄瓜、杨梅、银杏和石刁柏的雌、雄性别差异进行了鉴别研究［7-10］。BTB的变色范围为pH=6.0～7.6，酸性呈黄色，碱性呈蓝色，中间经过绿色，通过颜色的不同变化，鉴定出雌雄株。本研究通过提取出黄连木幼叶、花蕾、树皮中浸提物，加入BTB溶液后根据颜色变化不同，确定其雌雄株。现将研究结果报道如下：

1　材料与方法

1.1材料

材料为黄连木的幼叶、花蕾、树皮。黄连木的雄株从莆田市仙游县黄尾镇石井村取得，黄连木雌株从莆田市秀屿区东庄石码村取得。材料采集后立即放进装冰盒中，带回实验室置4℃冰箱中保存。

试剂为0.1%mol/L BTB，0.2 mol/L磷酸二氢钠，0.2mol/L磷酸氢二钠，9.5%氨水，0.1 mol/L盐酸。

1.2主要设备及仪器

TDL5台式离心机（上海上荣生化仪器厂），HH-4水浴锅（北京市医疗设备厂），722型分光光度计（北京宾达英创科技有限公司），pH计，电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（有限公司）等。

1.3实验方法

选取生长健壮的雌雄植株的叶、花蕾、树皮各0.2 g，用流水冲洗后吸干水分，加4 mL 0.1mol/L pH为6.2的磷酸缓冲液，在冰浴中研磨，研磨要快速，防止褐变，研磨好后快速装进离心管中，盖好，在室温下浸提1 h，然后把提取液置于4 000 r/min的离心机中离心5 min，取上清液3 mL，加BTB溶液4～5滴，摇匀，置于30℃恒温水浴锅中保温，每隔1 h记录提取液的颜色变化，然后用722型分光光度计分别测定提取液在450、550、650 nm处的吸光值。

2　结果和分析

黄连木各部分提取液在加BTB后颜色变化情况见表1。黄连木的花蕾提取液滴入BTB溶液后颜色均变为黄绿色。随着时间的推移，黄连木雄株提取液逐渐由黄绿色变成淡黄色到黄色，雌株提取液的颜色黄绿色，2 h后开始出现褐变，3 h后完全变成褐色。

表1　黄连木各种提取液的颜色变化

黄连木的幼叶跟花蕾的提取液变化相似，滴入BTB溶液后颜色均变为黄绿色。随着时间的延长，黄连木雄株提取液逐渐由黄绿色—淡黄色—黄色的变化，雌株提取液的颜色黄绿色，2 h后开始出现褐变，3 h后完全变成褐色，实验过程明显看到雌雄株颜色变化的差异。

黄连木的树皮跟幼叶有所不同，滴入BTB溶液后颜色均变为黄绿色。随着时间的推移，黄连木雄株提取液的颜色逐渐变为黄绿色—淡黄色—淡黄褐色，黄连木雌株提取液为黄绿色，2 h后开始出现褐变，3 h后完全变成褐色。6 h后，雌株提取液的颜色变化不明显，雄株提取液呈淡黄褐色。

由图1可以看出，黄连木雌雄株花蕾提取液随着时间的增加吸光值都增大。雌株提取液在450 nm的的吸光值急剧增大，而雄株提取液的吸光值缓慢增加。雌株提取液吸光值的增加幅度大，雄株提取液增加梯度小，从雌雄提取液吸光度差异也显示了彼此之间的不同。

图1　黄连木雌雄株花蕾提取液吸光值的变化

从图2得知，黄连木幼叶跟花蕾相似，黄连木雌株提取液在5～6 h的时波长为550 nm的吸光值增加幅度最大。雄株提取液的吸光值变化幅度非常小，这也可以做为鉴定雌雄株的一个参考。

图2　黄连木雌雄株幼叶提取液吸光值的变化

从图3可知，黄连木雌雄株树皮的提取液跟幼叶、花蕾有所区别。雌株树皮提取液在1～4 h波长为450 nm时增加幅度大，而后缓慢增加。

图3　黄连木雌雄株树皮提取液吸光值变化

根据图1～3的曲线图可知，黄连木雌雄株提取液随着时间的增加吸光值都增大。刚开始时，吸光值差距不大，随的时间的推移，差距变大。而黄连木的花蕾和树皮的吸光值差距较大。黄连木提取液在波长550、650 nm时吸光值变化幅度非常小，而在波长450 nm时，雌雄株提取液的吸光值变化大。

3　结论

黄连木雌雄株提取液加入BTB溶液后，1～2 h颜色变化相似。3 h开始出现明显变化，黄连木雌株提取液由淡黄色变褐色，随着时间的增加而加深，雄株提取液由淡黄色变黄色，随的时间增加但颜色变化不明显，依旧是黄色。根据这些实验结果，在黄连木人工造林时，可以用BTB的方法测定幼苗各种提取液颜色变化以确定其雌雄，以便合理搭配人工黄连木林的雌雄株比例。

黄连木提取液在波长550、650 nm时吸光值变化幅度非常小，不利于雌雄株的对比，而在波长450 nm时，雌雄株提取液的吸光值变化大，且雌雄株提取液的吸光值不同，黄连木雌株提取液的吸光值都比雄株提取液大，这个实验结果可作为黄连木幼苗雌雄株鉴别的参考。

用BTB法鉴定黄连木雌雄株，此方法较为快速、简单且有效，在生产中容易掌握，为黄连木幼苗的性别初步鉴定提供了依据，但这种方法并不能从遗传上揭示雌雄株的差异，所以，此方法只能作为黄连木幼苗雌雄株鉴定的一种辅助手段，其可靠性有待在生产实际中进一步观察。

［1］段劼，陈婧，马履一，等.木本油料树种中国黄连木研究进展［J］.中国农业大学学报，2012，17（6）：171-177.

［2］李瑞丽，卢龙斗，高武军，等.雌雄异株植物性别鉴定的研究进展［J］.广西植物，2006，26（4）：387-391.

［3］尹立辉，詹亚光，李彩华，等.植物雌雄株性别鉴定研究方法的评价［J］.植物研究，2003，23（1）：123-128.

［4］张淑兰，王华庆.银杏性别的早期鉴定［J］.生物学杂志，1994，58（2）：25.

［5］许良政.银杏雌雄株性别早期鉴别［J］.农业科技通讯，1996（4）：16.

［6］陈学好.黄瓜花性别分化的生理学研究［D］.扬州：江苏农学院，2001.

［7］龙程，潘瑞炽.用溴麝香草酚蓝鉴定石刁柏雌雄株［J］.植物生理学通讯，1991，27（3）：204-205.

［8］张雪明.利用溴麝香草酚蓝鉴定杨梅和银杏的雌雄性别［M］.武汉：中国植物生理学会第五次全国会议论文摘要，1990：228-229.

［9］龙程，潘瑞炽.影响溴麝香草酚蓝法鉴定石刁柏性别的几种因子［J］.植物生理学通讯，1992，28（2）：439-441.

［10］陈学好，陈艳萍，曹碚生，等.黄瓜雌雄株性别苗期化学鉴别方法［J］.中国蔬菜，2002，（4）：4-6.

（责任编辑：华伟平）

Preliminary Study on the Rapid Sex Identification of Pistacia Chinesis Female and Male Plants by Bromothymol Blue

YANG Lusheng1，LIGuoping2
（1.Office of Teaching Affairs，Wuyi University，Wuyishan，Fujian 354300；2.College of Ecology and Resource Engineering，WuyiUniversity，Wuyishan，Fujian 354300）

The identification of male and female plants of Pistacia chinensis was investigated by using bromothymol blue（BTB）method.Results showed that the solution color of extracts from female plants turned from kelly into brown 3 h after added in BTB solution，while the the solution color from male plants had no significant changes，maintaining the original yellow-green.As time increased，the solution color of female plants enhanced，while the the solution color ofmale plants had no changes.It was believed that the BTB staining method could be used to preliminary identify themale and female plants of Pistacia chinesis.The researchmight provide a scientific basis for the sex identification of Pistacia chinesis.

Pistacia chinesis；BTB solution；color change；sex identification

Q945.4

A文章标号：1674-2109（2016）06-0007-03

2015-01-01

福建省科技厅战略性新兴产业重点项目（2014N0030）；福建省科技创新平台建设计划项目（2013N2009）；福建省林业厅科学研究项目（闽林科［2013］5号）；国家级大学生创新创业训练计划项目（No.201410397006）；福建省科技厅项目（2016S0059）。

杨鹭生（1964-），女，汉族，高级实验师，主要从事植物生物技术研究。