PAX8、WT-1、HER2在不同转移方式的晚期卵巢上皮性癌中的差异表达

王丽丽郭红燕张雪辉张馨田

PAX8、WT-1、HER2在不同转移方式的晚期卵巢上皮性癌中的差异表达

王丽丽①郭红燕②张雪辉①张馨田③

目的：探讨PAX8、WT-1、HER2在不同转移方式的晚期卵巢上皮性癌中的表达差异，为临床治疗提供一定的理论基础。方法：收集临床样本，按照转移方式分为淋巴结转移组1例、混合转移组14例和盆腹腔转移组5例。采用实时定量荧光PCR方法检测PAX8、WT-1、HER2在20例不同转移方式的晚期卵巢上皮性癌中的相对表达量。结果：PAX8、WT-1、HER2在20例患者中均有表达；混合转移组PAX8、WT-1、HER2基因表达高于盆腹腔转移组。结论：PAX8、WT-1、HER2基因的表达可能与肿瘤的转移方式有关，可能成为提示预后的基因指标并对临床有一定提示作用，但仍需扩大样本进一步验证。

PAX8； WT-1； HER2； 晚期卵巢上皮性癌； 差异表达

First-author's address：Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China

卵巢上皮性癌是全球致死率最高的妇科恶性肿瘤之一，多见于中老年妇女，目前手术及化疗是其一线治疗方案。尽管手术技术不断提高，化疗药物不断更新，卵巢上皮性癌患者的预后却仍未得到显著改善，原因主要是卵巢的解剖学结构。卵巢癌起病隐匿，早期症状不明显，70%～80%的患者确诊时已是晚期，而晚期病例往往缺乏有效的治疗手段，出现转移和复发是其死亡的主要原因［1］。近年来研究发现这与卵巢上皮性癌的异质性有关，异质性在临床上的体现主要是：即使是相同组织学类型的晚期卵巢上皮性癌，转移途径却截然不同，如部分病例以盆腹腔广泛播散转移为主，淋巴结无转移；部分病例已出现广泛的淋巴结转移，但盆腹腔无广泛的播散灶；另一些患者盆腹腔及淋巴结均可见广泛的肿瘤转移。有研究发现PAX8、WT-1、HER2三种基因与卵巢上皮性癌的发生、发展、浸润和转移密切相关，本文旨在探讨PAX8、WT-1、HER2在不同转移类型的晚期卵巢上皮性癌中的表达含量的差异，从而为临床的诊断、治疗、预后评估提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集北京大学第三医院临床病理诊断为Ⅲ期和Ⅳ期的20例卵巢上皮性癌患者的组织标本，并将其分为三组：其中仅1例患者只出现淋巴结转移，病灶局限在盆腔，无腹腔转移（淋巴结转移组）；14例患者盆腹腔和淋巴结均有转移（混合转移组）；5例患者盆腹腔广泛转移，而淋巴结转移为阴性（盆腹腔转移组）。其中年龄≤45岁者6例，＞45岁者共14例；20例患者的组织病理学类型均为浆液性癌；除淋巴结转移组中1例患者为ⅢA1期外，其余均为ⅢA1期以上，其中ⅢA2期1例，ⅢB期5例，ⅢC期和Ⅳ期有13例；3例患者病理学分级为低级别，余17例为高级别。

1.2 主要生化试剂

1.2.1 化学试剂 包括Trizol、DEPC、琼脂糖、溴酚蓝、溴化乙锭、三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇。

1.2.2 分子量标准 Maker Ⅴ。

1.2.3 试剂盒 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（购自Thermo公司），IQTMSYBR Green Supermix（购自Bio-rad公司）。

1.2.4 引物设计与合成 普通引物使用Primer Premier 5.0软件设计，由北京奥科公司合成；Realtime PCR引物由Takara公司设计并合成。

1.2.5 主要仪器 微量低温高速离心机（Biofuge Stratos）购自Heraeus Instrument公司，凝胶成像分析系统（Gel Doc 2000）购自Bio-Rad公司，MyCycler®PCR仪购自Bio-Rad公司，高压蒸汽消毒器购自SANYO公司，Bio-rad Minioption PCR实时荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 提取组织中总RNA，逆转录合成cDNA 本实验采用Trizol试剂（购自Invitrogen公司）提取卵巢癌组织中的总RNA，并用紫外分光光度法测定RNA的浓度及纯度，最后使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（购自Thermo公司）将RNA反转录为cDNA。

1.3.2 检测PAX8、WT-1、HER2的相对表达量 笔者采用Real-time PCR方法进一步检测PAX8、WT-1、HER2三种基因在这20例卵巢上皮性癌患者的卵巢癌组织中的cDNA相对表达量，选定β-actin作为内参基因，从而计算目标基金相对表达量，实验过程和数据分析均于北京大学医学部药理系实验室完成，引物合成由Takara公司完成，引物序列和PCR反应条件如下：

反应在Bio-rad Minioption PCR（实时荧光定量PCR）仪中进行，反应体系如下：

Antisense primer PAX8CACTCCATTTGCTTGGCTCTTGGTGGTGCTATACCTTCACAG WT1TACCCAGGCTGCAATAAGAGATATTTTAAGCCTTTGGTGTCTTTTGAGCTGGTC HER2ATGAGCTACCTGGAGGATGTCCAGCCCGAAGTCTGTAATTT β-actinTCCACGAAACTACCTTCAACTCGGCAATGCCAGGGTACAT PCR conditions 95℃×5 min，40 cycles of 95 ℃×5 s，58 ℃×15 s GeneSense primer

ComponentVolume（μL）Primer（Forward and reverse）2 SYBR Green master mix（购自Bio-rad公司）10 cDNA2 ddH2O6

2 结果

2.1 三组患者PAX8、WT-1、HER2基因表达分布情况比较 PAX8、WT-1、HER2三种基因在20例患者中均有表达，表达分布如图1。

2.2 PAX8、WT-1、HER2在盆腹腔转移组和混合转移组中差异表达 由于淋巴结转移组仅有1例，易导致假阴性的出现，故进行统计学分析时未列入比较。混合转移组中三种基因的表达均高于盆腹腔转移组，在混合转移组中，HER2基因的表达量约为盆腹腔转移组的3.5倍，PAX-8基因的表达量约为盆腹腔转移组的2.5倍，而WT-1基因的表达量约为盆腹腔转移组的2倍，见图2。

3 讨论

PAX8基因属于转录因子配对盒基因家族，PAX家族蛋白是均由128个氨基酸形成的高度保守区域，该配对盒可识别特异DNA结合部位，启动转录，控制基因调节。现已证明，PAX8在胚胎发育中具有重要作用，尤其是对甲状腺、肾脏、Wolffian管和Mullerian管的形成起关键作用，但在胚胎成熟后，PAX8的表达量大幅减少。

图1 三组PAX8、WT-1、HER2基因表达分布

图2 PAX8、WT-1、HER2在盆腹腔转移组和混合转移组中差异表达

有研究表明，在某些癌症细胞中，PAX8的表达量较高，如原发性及转移性卵巢上皮性肿瘤［2-3］。有学者发现PAX8在卵巢浆液性、子宫内膜样、透明细胞癌及卵巢上皮包涵囊肿中存在高表达，可以用于区分浆液性卵巢癌与恶性间皮瘤，也可以区分卵巢癌与乳腺癌［4-5］。另外，有报道证实PAX8对卵巢癌细胞的增殖中起关键性作用，在16%的原发性卵巢肿瘤中扩增，有望成为治疗卵巢癌的药物靶点［6-7］。

WT-1基因位于人11号染色体短臂1区3带，长约50 kb，有10个外显子，富含“GC”同源序列。WT-1基因是在对遗传肾脏胚胎肿瘤（Wilm's tumor）的分子遗传学机制进行研究时发现的，并最先在肾母细胞癌中被定义为抑癌基因，但近来的研究表明它也有癌基因的作用，同时WT-1基因也可以激活某些基因的转录［8］。WT-1基因的正常功能是调控细胞生长，抑制其过分增殖，当WT1基因发生突变、缺失或失活，则失去调控细胞生长的功能，导致肿瘤的发生。WT-1基因编码的蛋白也具有极为复杂的生理功能，它同时具有活化和抑制的双重作用，在多种肿瘤的发生与发展过程中起着重要作用［9］。

文献［10］报道，WT-1在卵巢浆液性乳头状癌的阳性表达率高，而在卵巢子宫内膜样癌和大多数子宫内膜浆液性乳头状癌表达则呈阴性，这可能对卵巢上皮性癌的分类诊断有所帮助。Goldstein等［11］在30例卵巢浆液性乳头状癌中研究发现有29例WT-1阳性表达，阳性率为97%，而18例子宫内膜浆液性乳头状癌WT-1均为阴性。亦有研究表明，WT-1基因在52/67（93%）的卵巢浆液性癌中都有表达，但在粘液性癌、子宫内膜癌和透明细胞癌中并没有观察到此现象。另外WT-1表达与卵巢浆液性癌的分级和分期有关［12］。以上均说明WT-1基因可以作为诊断浆液性卵巢癌和判断浆液性卵巢癌分期分级的指标。

HER2即c-erbB-2基因编码的跨膜受体样蛋白，是表皮生长因子受体（EGFR）家族的成员之一。HER2基因在正常情况下处于非激活状态，当受到体内外某些因素作用后，该基因被异常激活，HER2蛋白异常高表达，进而引起瀑布式的连锁反应，启动胞内异常增殖的传导通路，促进细胞生长、增殖、分化和迁移，从而诱发肿瘤形成。一方面，HER2与其他受体结合成异二聚体后能发挥信号转导功能；另一方面，HER2的异二聚体使EGFR在细胞膜过表达，加速了细胞的增殖，以上两点与HER2在肿瘤细胞的增殖生长、侵犯和转移密切相关。

有研究表明，15%～30%的卵巢癌在HER2/neu蛋白过度表达，HER2/neu蛋白过度表达与卵巢癌患者较短存活期呈负相关，可作为预后因素，HER2的高表达与肿瘤细胞的转化、增殖及侵袭转移密切相关［13-14］。Suo等［15］发现HER2蛋白表达水平高低与卵巢癌的分化程度关系密切，在多数低分化的卵巢癌组织中HER2的表达水平较高。文献［16-17］对164例晚期卵巢癌进行研究，发现其中HER2过表达率为16%，但未发现HER2过表达与临床病理参数、组织学类型及病理分期有相关性。经上述研究提示：PAX8、WT-1、HER2与卵巢上皮性癌本身特征和浸润、转移关系密切，故笔者选取上述三种基因分别分析在不同转移方式的Ⅲ期和Ⅳ期卵巢上皮性癌中的表达差异。

本文研究结果表明：PAX8、WT-1、HER2三种基因在20例患者中均有表达；混合转移组中三种基因的表达含量均高于盆腹腔转移组，其中HER2基因的表达量约为盆腹腔转移组的3.5倍，PAX-8基因的表达量约为盆腹腔转移组的2.5倍，而WT-1基因的表达量约为盆腹腔转移组的2倍。这对于临床工作具有一定的提示作用：PAX8、WT-1、HER2基因表达与晚期卵巢上皮性癌转移密切相关，可能成为提示预后情况的基因指标，并且通过检测基因表达的含量可能为手术方式的选择提供一定的参考。但是由于所收集的病例数较少，在分析混合转移组和盆腹腔转移组的PAX8、WT1、HER2基因相对表达量时，两者之间并没有出现显著的统计学差异，且由于淋巴结转移组只有1例，为了避免统计误差的出现未将其纳入研究，所以笔者无法分析只有淋巴结转移，病灶局限在盆腔这类患者的基因相对表达量与其他两组的差异。然而，本次研究只是作为基础研究的一次初试，并且已经显示出了一定的临床价值，以后将收集更多的组织样本分析不同转移方式晚期卵巢上皮性癌中三种基因的差异表达，还要在早期卵巢上皮性癌患者以及正常卵巢组织中进一步进行验证，以期找到新的可靠的卵巢肿瘤标志物。

综上所述，卵巢上皮性癌是致死率极高的妇科肿瘤，同时也是一种高度异质性的疾病。在临床上主要体现在：相同组织学类型的卵巢上皮性癌却存在不同的生物学行为（即临床表现不同），治疗效果和预后也不尽相同。PAX8、WT-1、HER2三种基因与卵巢上皮性癌的发生、发展、浸润和转移密切相关。盆腹腔和淋巴结均有转移时三种基因的表达高于只有盆腹腔转移而淋巴结阴性者，这对临床有一定指导作用，可能成为提示预后情况的基因指标或者为手术方式的选择提供一定的基础。但是需扩大组织样本进一步验证。

［1］ Rose S L，Goodheart M J，DeYoung B R，et al.P21 expression predicts outcome in p53-null ovarian carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2003，9（3）：1028.

［2］ Mittag J，Winterhager E，Bauer K，et al.Congenital hypothyroid female pax8-deficient mice are infertile despite thyroid hormone replacement therapy［J］.Endocrinology，2007，148（2）：719.

［3］ Bouchard M，de Caprona D，Busslinger M，et al.Pax2 and Pax8 cooperate in mouse inner ear morphogenesis and innervation［J］. BMC Dev Bio1，2010，10（1）：1-17.

［4］ Bowen N J，Logani S，Dickerson E B，et al.Emerging roles for PAX8 in ovarian cancer and endosalpingeal development［J］. Gynecol Oncol， 2007，104（2）：331-337.

［5］ Kroll T G，Sarraf P，Pecciarini L，et al.PAX8-PPAR gamma1 fusion oncogene in human thyroid carcinoma［J］.Science，2000，289（5483）：1357.

［6］ Paulette M F，Dan W，Damanzoopinder S，et al.Pair Box 8（PAX8）protein expression in high grade，late stage（stageⅢAnd Ⅳ） ovarian serous carcinoma［J］.Gynecol Oncol，2012，127（1）：198.

［7］ Cheung H W，Cowley G S，Weir B A，et al.Systematic investigation of genetic vulnerabilities across cancer cell lines reveals lineage-specific dependencies in ovarian cancer［J］.Proc Natl Acad Sci，2011，108（30）：12 372.

［8］ Pritchard-Jones K，Hastie N D.Wilms' tumour as a paradigm for the relationship of cancer to development［J］.Cancer Surv，1990，9（3）：555.

［9］ Werner H.Increased expression of the insulin-like growth factor 1 receptor gene，IGF1R，in Wilms tumor is correlated with modulation of IGF1R promoter activity by the WT-1 Wilms tumor gene product［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90（12）：5828.

［10］ Wang Z Y.The Wilms' tumor gene product，WT-1，represses transcription of the platelet-derived growth factor A-chain gene［J］.J Biol Chem，1992，267（31）：21 999.

［11］ Goldstein N S，Uzieblo A.WT-l immunoreactivity in uterine papillary serous carcinomas is different from ovarian serous carcinomas［J］.Am J Clin pathol，2002，117（4）：541.

［12］ Al-Hussaini M，Stockman A，Foster H，et al.WT-1 assists in distinguishing ovarian from uterine serous carcinoma and in distinguishing between serous and endometrioid ovarian carcinoma［J］.Histopathology，2004，4（2）：109.

［13］ Huang L W，Garrett A P，Bell D A，et al.Diferential expression of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 protein and mRNA in epithelial ovarian tumours［J］.Gynecol Oncol，2000，77（3）：369.

［14］ Sebastian S，Settleman J，Reshkin S J，et al.The complexity of targeting EGFR signaling in cancer：from expression to turnover［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1766（1）：120.

［15］ Suo Z，Karbovo E，Trope C G，et al.Papillary serous carcinoma of the ovary：an ultrastructural and immunohistochemieal study［J］.Ultrastruct Pathol，2004，28（3）：141.

［16］ Camilleri-Broet S，Hardy-Bessard A C，Le-Tourneau A，et al.HER-2 overerexpression is an independent marker of poor prognosis of advanced primary ovarian carcinoma，a multicenter study of the G1NECO group［J］.Ann Oncol，2004，15（1）：104.

［17］ Gessler M，Poustka A，Cavenee W，et al.Homozygous deletion in Wilms tumours of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping［J］.Nature，1990，343（6260）：774.

Differential Expression of PAX 8，WT-1 and HER2 in Advanced Epithelial Ovarian Cancer with Different Metastatic Modes

WANG Li-li，GUO Hong-yan，ZHANG X ue-hui，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（27）：020-024

Objective：To explore the differential expression of PAX8，WT-1 and HER2 in advanced epithelial ovarian cancer with different metastatic modes and provide some theoretical basis for clinical treatment. Method：The clinical samples were collected，they were divided into lymph node metastasis group of 1 case，mixed metastasis group of 14 cases and pelvic-abdominal metastasis group of 5 cases according to the metastasis ways.The relative expression of PAX8，WT-1 and HER2 in 20 patients with advanced epithelial ovarian cancer were detected by real-time quantitative fluorescent PCR method.Result：20 cases all had expressed PAX8，WT-1 and HER2.The expression of PAX8，WT-1 and HER2 in mixed metastasis group was higher than that of pelvicabdominal metastasis group.Conclusion：The expression of PAX8，WT-1 and HER2 may be associated with the metastasis way of tumor，and probably become the genetic indicators for clinical work，but it is necessary to expand the sample for further validation.

PAX8； WT-1； HER2； Advanced epithelial ovarian carcinoma； Differential expression

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.27.006

①北京大学附属第三医院 北京 100191

②北京大学第三医院

③中山大学中山医学院

郭红燕

（2016-07-17） （本文编辑：李颖）