蛭丹化瘀组方制剂的质量研究

刘怡，李任，王丽丽，沈素

（首都医科大学附属北京友谊医院，北京100050）

蛭丹化瘀组方制剂的质量研究

刘怡，李任，王丽丽，沈素

（首都医科大学附属北京友谊医院，北京100050）

目的建立同时测定中药制剂蛭丹化瘀组方中芍药苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素含量的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，并探讨口服液、配方颗粒和浸膏剂的质量差异。方法色谱柱采用Kromasil 100-5 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 m）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱；上述4种活性成分检测波长分别为230，320，274，248 nm；流速1.5 mL/min。结果芍药苷在进样量为0.5～5.0 g范围内与峰面积线性关系良好（n=5）；阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素在进样量为0.04～0.4 g范围内与峰面积线性关系良好（n=5）；各成分加样回收率分别为98.92%，96.47%，98.93%，102.48%（RSD=1.54，1.15，1.42，1.97，n=6）；3种蛭丹化瘀组方制剂中各有效成分含量不同。结论该法可用于蛭丹化瘀组方制剂的质量控制，不同工艺可能导致制剂中有效成分含量的差异。

蛭丹化瘀方；芍药苷；阿魏酸；芒柄花素；丹皮酚；含量测定；高效液相色谱法

蛭丹化瘀口服液是首都医科大学附属北京友谊医院的医院制剂，适用于气血凝滞造成的肺络痹阻［1-2］。临床用于治疗小儿病毒性肺炎30余年，可有效促进患儿咳嗽、咳痰等症状的好转，加快肺部罗音或水泡音的吸收，可有效缩短患儿住院时间，且安全性良好，是辅助治疗小儿病毒性肺炎的理想药物。蛭丹化瘀组方由牡丹皮、当归、赤芍、鸡血藤和川芎等7味中药组成，曾采用薄层色谱法进行对照试验，无法进行定量测定。本研究中参考文献［3-5］，建立了蛭丹化瘀配方颗粒中芍药苷、阿魏酸、丹皮酚、芒柄花素4种成分含量的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定方法，该方法专属性好、灵敏度高，并对蛭丹化瘀口服液、配方颗粒和浸膏剂中上述4种有效成分进行含量测定，为探讨蛭丹化瘀配方组方的质量控制、确保患者用药的安全有效提供研究基础。

1　仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；TP 300型超声波提取器（天鹏电子新技术北京有限公司）；JA1003型电子分析天平（上海精科天平仪器厂）；Milli-Q Integral型超纯水仪（密理博中国有限公司）。

1.2试剂

蛭丹化瘀口服液、配方颗粒和浸膏剂样品由首都医科大学附属北京友谊医院药学部提供；对照品芍药苷（批号为110736-201438，纯度96.4%）、阿魏酸（批号为110773-201012，纯度98%）、丹皮酚（批号为110708-201407，纯度99.9%）、芒柄花素（批号为111703-200603，纯度96.4%），均购于中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱级试剂，均购自默克股份有限公司；甲酸（分析纯试剂，国药集团化学试剂有限公司）。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱，0～10 min 85%B，10～15 min 76%B，15～20 min 70%B，20～30 min 50%B；检测波长：0～8 min 230 nm，8～12 min 320 nm，12～26 min 274 nm；26～30 min 248 nm；流速：1.5 mL/min；柱温：30℃；进样量：10 μL。2.2溶液制备

对照品溶液：分别精密称取阿魏酸、芒柄花素和丹皮酚对照品各10 mg，置100 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，得质量浓度为100 μg/mL阿魏酸、芒柄花素、丹皮酚混合对照品母液；精密称取芍药苷25 mg，置50 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，得质量浓度为500 μg/mL的芍药苷对照品母液；精密移取阿魏酸、芒柄花素和丹皮酚对照品母液2 mL，芍药苷对照品母液5 mL，置10 mL容量瓶中，甲醇定容，得到阿魏酸、芒柄花素和丹皮酚质量浓度均为20 μg/mL，芍药苷质量浓度为250 μg/mL的对照品溶液。

供试品溶液：取相当于22 g原药材的配方颗粒，置25 mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声提取30 min，放置至室温，加入甲醇定容，适当稀释后过0.45 μm滤膜，得到供试品溶液。

阴性对照品溶液：以配方颗粒为例，取去除当归、川芎的配方颗粒，置25 mL容量瓶中，加入适量甲醇超声提取30 min，放置至室温，加入甲醇定容，过0.45 μm滤膜，得阿魏酸阴性对照品溶液。以配方颗粒为例，取去除牡丹皮、赤芍的配方颗粒，置25 mL容量瓶中，加入适量甲醇超声提取30 min，放置至室温，加入甲醇定容，过0.45 μm滤膜，得芍药苷、丹皮酚阴性对照品溶液。以配方颗粒为例，取去除鸡血藤、黄芪的配方颗粒，置25 mL容量瓶中，加入适量甲醇超声提取30 min，放置至室温，加入甲醇定容，过0.45 μm滤膜，得芒柄花素阴性对照品溶液。

2.3方法学考察

专属性考察：精密吸取阴性对照品溶液、对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按照拟订色谱条件进样测定。结果配方颗粒阴性对照品溶液对供试品溶液的测定无干扰，各待测成分分离良好，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

标准曲线绘制：分别精密吸取芍药苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素对照品溶液2，5，10，15，20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得回归方程。芍药苷为Y=1 048.2X+52.805，r2=0.999 3；阿魏酸为Y= 3 303.4 X-1.5122，r2=1；芒柄花素为Y=4 036.9 X+ 0.122，r2=0.999 6；丹皮酚为Y=4 198.2 X+0.780 5，r2=1。结果表明，芍药苷在进样量为0.5～5.0 μg范围内与峰面积线性关系良好（n=5）；阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素在进样量为0.04～0.4 μg范围内与峰面积线性关系良好（n=5）。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积并计算精密度。以配方颗粒为例，结果芍药苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素峰面积的RSD分别为0.6%，0.3%，0.1%和0.1%（n=6），表明仪器精密度良好。

图1　高效液相色谱图

稳定性试验：依法配制成供试品溶液，分别于0，6，12，24 h时进样10 μL，依法测定。以配方颗粒为例，结果供试品溶液中芍药苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素峰面积的RSD分别为1.4%，1.2%，1.3%，1.3%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：精密吸取2.2项下同一供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，计算供试品溶液中芍药苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素的含量。以配方颗粒为例，结果4种成分的RSD分别为1.2%，0.3%，0.5%和0.8%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密吸取6份已知含量的供试品溶液，分别精密加入适量芍药苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素对照品溶液，甲醇定容后精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图并计算回收率。以配方颗粒为例，结果见表1。

2.4样品含量测定

精密量取蛭丹化瘀口服液、配方颗粒和浸膏剂，依法制备供试品溶液，精密移取10 μL，注入高效液相色谱仪测定，记录峰面积，以外标法计算样品中各成分含量。结果见表2。

3　讨论

3.1活性成分选择

芍药苷是赤芍中活性成分，具有改善微循环、抗氧化等多种生物学效应，且毒副作用较小［6］。阿魏酸是川芎和当归中的活性成分，具有很好的抗血栓、抗菌消炎的作用［7］。丹皮酚是牡丹皮中活性成分，具有活血、促进微循环、增强免疫等作用［8］。芒柄花素是鸡血藤中活性成分，可以有效减轻炎症因子对气道上皮细胞损害［9］。上述活性成分均可能有助于炎症的好转和恢复，并为赤芍等中药材的指标成分，故选择此4种活性成分作为指标以对蛭丹化瘀组方进行质量研究。

3.2质量差异原因

表1　加样回收试验结果（n=6）

表2　3种蛭丹化瘀组方制剂中芍药苷、阿魏酸、芒柄花素和丹皮酚含量测定结果（±s，n=3）

表2　3种蛭丹化瘀组方制剂中芍药苷、阿魏酸、芒柄花素和丹皮酚含量测定结果（±s，n=3）

注：mg/g及 g/g为相当于每1 g生药中含待测物量；每10 mL口服液、3.77 g配方颗粒和4.5 mL浸膏剂相当于22 g生药；-为含量低于4.55 g/g。

制剂配方颗粒口服液（批号为1 5 1 1 0 1）浸膏剂芍药苷（m g / g）1 . 4 5 ± 0 . 0 2 1 . 3 2 ± 0 . 0 1 3 . 4 8 ± 0 . 0 1阿魏酸（ g / g）2 9 . 3 5 ± 1 . 3 1 8 . 7 5 ± 0 . 5 0 6 5 . 7 7 ± 0 . 5 1丹皮酚（ g / g）2 1 . 0 1 ± 1 . 7 2 -4 8 3 . 9 4 ± 4 . 9 9芒柄花素（ g / g）6 . 8 3 ± 0 . 3 2 --

由表2可知，与蛭丹化瘀口服液相比，配方颗粒中阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素的含量均高于口服液制剂，说明将蛭丹化瘀口服液按照组方比例制备成配方颗粒后，该4种有效成分均有不同程度的提高。体外抗呼吸道合胞（RSV）试验证明，配方颗粒与蛭丹化瘀口服液具有相同的抗病毒活性［10］。另外，配方颗粒还可克服口服液普遍存在相对生产成本较高、工艺复杂、运输贮存不便等缺点，提高医院制剂效率。浸膏剂中丹皮酚含量远高于其他两种制剂，这是因为浸膏制备过程中，首先采用蒸馏法提取了牡丹皮中的丹皮酚，采用β-环糊精将丹皮酚包合在其筒状结构中，有效地提高了挥发性成份丹皮酚的浓度和稳定性。包合物技术可以有效提高中药挥发油性成份在制剂中的含量和稳定性，在一定程度上提高制剂的质量和疗效。

3.3缺点与不足

蛭丹化瘀组方中还包括黄芪，黄芪甲苷为其重要活性成分，在减少炎症物质的产生、清除氧自由基和抗病毒等方面具有良好活性［11］。对组方中的黄芪甲苷进行含量测定，可进一步对该组方的质量进行有效研究和控制，但黄芪甲苷紫外吸收在210 nm波长附近，末端吸收影响较大，难以采用高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UV）方法进行测定，在未来研究中拟采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法对黄芪甲苷的含量进行测定，从而进一步研究蛭丹化瘀不同制剂的质量差异和质量控制。

本试验中首次建立了RP-HPLC法同时测定芍药苷、阿魏酸、丹皮酚和芒柄花素的含量测定方法，该方法可用于蛭丹化瘀组方的质量研究，简单便捷、准确可靠。蛭丹化瘀配方颗粒和浸膏剂均能不同程度地提高芍药苷等有效成分在制剂中的含量，对于改进剂型、提高蛭丹化瘀组方疗效具有积极意义。

［1］林燕，姜之炎.肺炎支原体肺炎中医病机“肺络痹阻”与6-Keto-PGFla、TXB2含量的临床意义［J］.辽宁中医药大学学报，2016，18（3）：123-126.

［2］黄维良，许爱婷.中医药治疗小儿病毒性肺炎的思路与方法［J］.河南中医，2015，35（12）：3 061-3 062.

［3］王思路，龚晓苏，张铁军，等.HPLC法测定黄芪不同炮制品中芒柄花素［J］.现代药物与临床，2013，28（4）：550-552.

［4］袁鹏飞，刘焕，尚明英，等.桂枝汤中9种主要成分含量测定和不同煎煮方式的比较研究［J］.中国药房，2016，27（6）：801-805.

［5］Xie Y，Jiang ZH，Zhou H，et al.The pharmacokinetic study of sinomenine，peaoniflorin and paeonal in rats after administration of a herbal product Qingfu Guanjiesu capsule by HPLC［J］.Biomedical Chromatography，2014，28（9）：1 294-1 302.

［6］郑世存，李晓宇，欧阳病，等.芍药苷药理作用研究进展［J］.中国药物警戒，2012，9（2）：100-103.

［7］梁娜，孙少平，罗跃娥，等.阿魏酸的研究进展［J］.黑龙江中医药，2009（3）：39-40.

［8］郭齐，李贻奎，王志国，等.丹皮酚药理研究进展［J］.中医药信息，2009，26（1）：20-22.

［9］范欣生，余晶华，唐于平，等.芒柄花素在制备防治呼吸道炎症、哮喘药物中的应用：中国，CN102552241A［P］.2012-07-11.

［10］刘玉华，叶会初，黄敏君.蛭丹化瘀中药配方颗粒冲剂与饮片煎剂体外抗RSV作用比较［J］.临床和实验医学杂志，2004，3（3）：152-153.

［11］孙豪栋，庞晓斌，李继扬.黄芪甲苷生物活性研究进展［J］.中国药房，2011，22（7）：657-661.

Quality Study of Zhidan Huayu Preparation

Liu Yi，Li Ren，Wang Lili，Shen Su
（Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing，China100050）

ObjectiveTo establish an RP-HPLC method for the simultaneous content determination of paeoniflorin，ferulic acid，paeonol and formononetin in Zhidan Huayu Prescription，and to investigate the quality differences among oral liquid，particle formulation and extract of Zhidan Huayu Prescription.M ethodsThe Kromasil 100-5 C18column was used.Gradient elution was developed.The detection wavelength was at 230，320，274 and 248 nm for the above 4 components.The flow rate was 1.5 mL/min.ResultsThe method was specific，accurate and sensitive for the content determination of the 4 components.The content of these components were different in oral solution，concreteand compatiblegranule.ConclusionTheRP-HPLCmethod can beused for quality controlof Zhidan Huayu Prescription.Different preparation process may affect the quality the effective component in the prescription.

Zhidan Huayu Prescription；herbaceous peony；ferulic acid；paeonol；formononetin；content determination；HPLC

R284.1；R286

A

1006-4931（2016）15-0024-04

北京市科学技术委员会“十病十药”研发项目，项目编号：Z141100002214019。

刘怡（1984-），女，博士研究生，药师，研究方向为临床药学，（电话）010-63138510（电子信箱）woshi_yybb@163.com；沈素（1961-），女，大学本科，主任药师，研究方向为医药管理和临床药学，本文通讯作者，（电子信箱）shensu11022000@163.com。

（2016-03-22）