人LDH-B 基因克隆及其真核表达载体的构建*

胡湘麟，卿鑫，曾凡才△

（西南医科大学：1.临床医学院；2.生物化学与分子生物学实验室，四川泸州646000）

人LDH-B 基因克隆及其真核表达载体的构建*

胡湘麟1，卿鑫2，曾凡才2△

（西南医科大学：1.临床医学院；2.生物化学与分子生物学实验室，四川泸州646000）

目的克隆人乳酸脱氢酶B（LDH-B）基因并构建其真核表达载体。方法提取人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的总RNA，逆转录生成cDNA，以cDNA为模板，采用PCR扩增获得LDH-B基因编码区序列片段，限制性核酸内切酶Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切LDH-B基因片段及pUC19质粒，连接反应构建pUC19-LDH-B克隆载体，并将其转入大肠埃希菌DH5α感受态细胞，蓝白筛选挑取白色菌落，酶切验证后测序鉴定。将序列正确的LDH-B基因亚克隆到pcDNA3.1（-）载体上，构建LDH-B真核表达载体pcDNA3.1（-）-LDH-B。结果PCR扩增后可见约1.0 kb的特异性条带，与预期的LDH-B片段长度相符合；Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切pUC19-LDH-B后可见约2.6 kb和1.0 kb的条带，分别与pUC19和LDH-B的片段长度相符合，LDH-B测序结果与DNA序列数据库（Genebank）中的参考序列相一致；Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切pcDNA3.1（-）-LDH-B后可见约5.5 kb和1.0 kb的条带，分别与pcDNA3.1（-）和LDH-B的片段长度相符合。结论成功克隆了人LDH-B基因，并构建了其真核表达载体，为进一步探究LDH-B的生物学功能奠定了基础。

L-乳酸脱氢酶；基因；克隆，分子；遗传载体；真核细胞

乳酸脱氢酶（LDH）是糖酵解最后一步反应中负责催化丙酮酸与乳酸相互转变的一组同工酶，是由LDH-A和LDH-B 2种亚基以不同的比例组装而成，主要有LDH1（B4）、LDH2（A1B3）、LDH3（A2B2）、LDH4（A3B1）、LDH5（A4）5种形式。通常情况下，LDH1和LDH2存在于心肌并催化乳酸生成丙酮酸，而LDH4和LDH5存在于骨骼肌并催化丙酮酸生成乳酸，即四聚体中LDH-A的比例越高，则该同工酶催化丙酮酸发生乳酸反应的能力也就越强。研究发现，LDH4和LDH5还普遍高表达于恶性肿瘤组织中，通过上调LDH-A/LDH-B比例，促进肿瘤乳酸产生，造成组织乳酸堆积，密切影响着肿瘤的增殖、侵袭和转移。抑制LDH-A以减少乳酸生成被认为是抗肿瘤治疗的理想靶点之一［1-2］。

LDH-B作为构成LDH的另一种亚基形式，有着与LDH-A相反方向的催化功能。Bonuccelli等［3］在免疫组织化学染色中发现，LDH-B会选择性地高表达于乳腺癌的肿瘤间质，可能在支持癌细胞的生长上同样发挥着作用。目前，LDH-A在肿瘤发生发展过程中的作用已备受关注和论述，而有关LDH-B与肿瘤关系的研究却仍需进一步阐明。因此，本实验研究旨在克隆人LDH-B基因，并通过构建其真核表达载体，为进一步探究LDH-B的生物学功能做好准备。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂T100型PCR扩增仪、凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司，TGL-16R型低温高速离心机购自珠海黑马医学仪器有限公司，ZHWY-2102C型恒温摇床购自上海智成分析仪器制造有限公司，电泳仪及水平电泳槽购自北京君意东方电泳设备有限公司。人乳腺癌MDA-MB-231细胞系、大肠埃希菌DH5α感受态菌株、pcDNA3.1（-）质粒均为本实验室保存，质粒抽提试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，PCR产物纯化试剂盒购自Roche公司，Trizol total RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、pUC19质粒、Taq DNA聚合酶、Bam HⅠ和KpnⅠ限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶均购自大连宝生物（TaKaRa）公司。

1.2方法

1.2.1引物设计根据DNA序列数据库（Genebank）所提供的人LDH-B基因mRNA序列（NM_002300.6），使用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，引物由上海Invitrogen公司合成。上游引物序列：5′-CGGGATCCAAAATGGCAACTCTTAAGG-3′，双下划线处为BamHⅠ酶切位点，单下划线处为起始密码子，5′端加入2个保护碱基；下游引物序列：5′-GGGGTACCTCACAGGTCTTTTAGGTC-3′，双下划线处为KpnⅠ酶切位点，单下划线处为终止密码子，5′端加入2个保护碱基。PCR扩增目标片段长度为1 006 bp。

1.2.2细胞总RNA的提取与逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）MDA-MB-231细胞系培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO2孵箱中待细胞生长近80%呈融合状态时收集细胞，使用Trizol total RNA试剂盒提取细胞总RNA，超微量紫外分光光度计测定总RNA浓度及吸光度（A）值。总RNA量固定为1 μg，使用逆转录试剂盒合成cDNA，操作严格按照试剂盒说明书进行。以cDNA为模板，PCR扩增LDH-B基因片段，共20.0 μL反应体系：15.4 μL ddH2O（双蒸水），2.0 μL 10×Taq buffer，0.4 μL Taq DNA聚合酶，0.4 μL dNTP mixture of 10 mmol/L，0.4 μL正向引物（10.0μmol/L），0.4 μL反向引物（10.0 μmol/L）和1.0 μL cDNA；反应条件：95℃预变性3min后，95℃变性30s，61℃退火30 s，

72℃延伸1 min，重复34个循环，72℃最后延伸5 min。PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳（120 V，30 min），溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色成像。

1.2.3LDH-B克隆载体的构建与鉴定紫外光下切取上述包含目的条带的凝胶块，使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切胶回收产物及pUC19质粒，根据1.0μL酶最大能切1.0μg DNA配置20.0μL酶切体系，37℃酶切1 h，酶切产物使用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，测量纯化后DNA的浓度及OD值。取酶切纯化后的pUC19载体DNA1.0μL（约50ng），酶切纯化后的目的基因片段20.0μL（约200ng），10×连接缓冲液5.0 μL，T4 DNA连接酶1.0 μL，加双蒸水至连接体系50.0μL，16℃连接过夜。取10.0μL连接液迅速加入至100.0 μL的DH5α感受态细菌中，冰浴30 min，42℃热激50 s，再次冰浴2 min，加入1 mL的LB液体培养基后，37℃、180r/min摇菌1h。取约200.0μL转化菌液涂布于含异丙基硫代半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和氨苄西林的LB固体平板上，37℃培养过夜。挑取平板上单个较大的白色菌落，接种于5 mL的LB液体培养基中，37℃、180 r/min摇菌12 h，提取质粒，Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切质粒以筛选重组成功的质粒。选取包含重组质粒的菌液送往广州光正物园研发中心进行DNA测序，运用美国国家生物技术信息中心中的BLAST工具进行序列比对。

1.2.4LDH-B真核表达载体的构建Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切含有正确LDH-B基因序列的重组质粒，酶切产物行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色成像后，紫外光下切取包含LDH-B基因的凝胶块，回收凝胶块中的LDH-B基因片段。Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切pcDNA3.1（-）质粒，纯化酶切产物。参照1.2.3步骤中的连接体系及条件，配制pcDNA3.1（-）-LDH-B连接液，并将其转化至DH5α感受态细菌，体外培养后将转化菌液涂布于含氨苄西林的LB固体平板上，37℃培养过夜。挑取平板上的菌落作模板，菌落PCR筛选出包含pcDNA3.1（-）-LDH-B的阳性菌落，Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切其质粒验证，挑选酶切验证阳性的菌落送往广州光正物园研发中心测序后进一步确认。

2　结果

2.1RT-PCR扩增LDH-B基因RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳、EB染色成像后，在1.0 kb处可见一明显的特异性条带（图1），与预期的LDH-B片段长度1 006 bp相符合。胶回收PCR产物，超微量紫外分光光度计测得浓度为10.12ng/μL，A260/A280=1.89。

2.2pUC19-LDH-B酶切验证及测序挑取蓝白筛选平板上的白色菌落，LB液体培养基扩大培养，提取质粒，Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切质粒，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳、EB染色成像后可见约2.6 kb和1.0 kb的条带（图2），分别与pUC19和LDH-B的片段长度相符合，表明pUC19-LDH-B克隆载体构建成功。测序结果经BLAST序列比对发现，目的片段的编码区碱基序列与Genebank中LDH-B的编码区参考序列一致性为100.0%，表明LDH-B基因克隆成功。

图1　PCR扩增LDH-B产物凝胶电泳结果

图2　pUC19-LDH-B酶切产物凝胶电泳结果

2.3pcDNA3.1（-）-LDH-B酶切验证菌落PCR筛选包含pcDNA3.1（-）-LDH-B重组质粒的阳性菌落，挑取单克隆摇菌提取质粒，Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切质粒后可见约5.5kb和1.0kb的条带（图3），分别与pcDNA3.1（-）和LDH-B的片段长度相符合，进一步测序后证明pcDNA3.1（-）-LDH-B真核表达载体构建成功。

图3　pcDNA3.1（-）-LDH-B酶切产物凝胶电泳结果

3　讨论

根据中国癌症统计数据显示，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发生率约占女性所有恶性肿瘤的15%，是45岁以下女性最常见的癌症死因［4］。乳腺癌是一组高度异质性的疾病，根据乳腺癌分子表达情况的不同，可将其分为多个亚型。其中三阴乳腺癌是指雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表达均为阴性的乳腺癌。三阴乳腺癌侵袭性强，恶性程度高，对传统的内分泌治疗及曲妥珠单抗靶向治疗均无反应，患者预后往往很差，因此，找出新的三阴乳腺癌的治疗靶点极为重要［5］。

Mccleland等［6］通过构建siRNA文库对8种三阴乳腺癌细胞系和3种管腔型乳腺癌细胞系共计79个基因进行筛选，发现LDH-B基因是唯一一个三阴乳腺癌增殖所特定需要的基因。在体外或体内实验中运用shRNA沉默LDH-B基因后，均会明显抑制三阴乳腺癌细胞的增殖或其移植瘤的生长。该研究小组认为，三阴乳腺癌更加依赖于糖酵解产能，这与三阴乳腺癌中LDH-B和单羧酸转运子1（monocarboxylate transporter，MCT1）的共表达有很大关系。LDH-B可能作为干预三阴乳腺癌生长的分子靶标。高表达LDH-B的乳腺癌患者常预示其总生存期和无疾病进展生存期较短。同时，Dennison等［7］通过蛋白质印迹结果发现，LDH-A在各种乳腺癌细胞系中均有表达，而LDH-B仅在三阴乳腺癌细胞系中高表达。shRNA沉默三阴乳腺癌细胞系的LDH-B基因后，将增加肿瘤细胞的氧化磷酸化。其临床数据统计发现，LDH-B是预测三阴乳腺癌术后复发的唯一指标，并且高度认为LDH-B可以用于预测新辅助化疗对乳腺癌的治疗效果。由此可见，LDH-B无论是在基础研究还是临床应用中，都与三阴乳腺癌之间有着十分紧密而特殊的联系。

明确LDH-B所涉及的分子机制是研究LDH-B的重要内容。Zha等［8］的研究证明，在高度激活的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）所介导的肿瘤发生过程中，LDH-B扮演着十分关键的角色。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/mTOR信号通路是机体调控细胞增殖、分化、代谢及血管形成等的一个重要信号通路，在许多恶性肿瘤中均发现有PI3K/Akt/mTOR信号通路的持续性激活，包括乳腺癌［9］。Zha等［8］研究发现，mTOR是LDH-B的正调节分子，会促进细胞LDH-B的表达，即高度激活的mTOR能够上调其下游的细胞信号转导与转录激活因子3（STAT3），STAT3是一种转录因子，继而激活LDH-B基因的转录而促进LDH-B分子的表达，即构成mTOR/STAT/LDH-B信号转导通路，认为LDH-B可能会成为一个有效的靶点，用于治疗由PI3K/Akt/mTOR异常激活所导致的肿瘤。

在最近一项对乳腺癌荷瘤小鼠的研究中，科学家们发现，经过持久运动和锻炼的荷瘤小鼠，其瘤体内LDH-B的表达水平将会增高，而LDH-A的表达水平则降低。此外，LDH同工酶电泳显示，经过持久锻炼的荷瘤小鼠，在瘤体中开始更多地表达LDH1和LDH2，而未经锻炼的荷瘤小鼠在瘤体中仍较高地表达LDH4和LDH5［10］。

本实验研究所选取的MDA-MB-231细胞系即为ER、PR和HER2均不表达的三阴乳腺癌细胞系，通过分、切、接、转、筛等一系列的经典操作，成功克隆了LDH-B基因的编码区序列，并构建了其真核表达载体pcDNA3.1（-）-LDH-B。在下一步的实验方案中，本课题组计划将pcDNA3.1（-）-LDH-B转染入T47D、MCF-7等不表达LDH-B的乳腺癌细胞系，并用蛋白质印迹法检测LDH-B分子的过表达，以探究过表达LDH-B分子会对LDH同工酶酶谱产生如何的影响，过表达的LDH-B分子是否会对肿瘤的增殖、迁移和侵袭等生物学行为产生影响等。

总之，本研究为进一步探究LDH-B的生物学功能奠定了基础。开展LDH-B与乳腺癌等肿瘤关系的研究具有十分重要的意义。

［1］MiaoP，ShengS，SunX，etal.LactatedehydrogenaseAincancer：apromising target for diagnosis and therapy［J］.IUBMB Life，2013，65（11）：904-910.

［2］Augoff K，Hryniewicz-Jankowska A，Tabola R.Lactate dehydrogenase 5：an old friend and a new hope in the war on cancer［J］.Cancer Lett，2015，358（1）：1-7.

［3］Bonuccelli G，Whitaker-Menezes D，Castello-Cros R，et al.The reverse Warburg effect：glycolysis inhibitors prevent the tumor promoting effects of caveolin-1 deficient cancer associated fibroblasts［J］.Cell Cycle，2010，9（10）：1960-1971.

［4］Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015［J］. CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

［5］Hudis CA，Gianni L.Triple-negative breast cancer：an unmet medical need［J］.Oncologist，2011，16（Suppl 1）：1-11.

［6］Mccleland ML，Adler AS，Shang Y，et al.An integrated genomic screen identifies LDHB as an essential gene for triple-negative breast cancer［J］. Cancer Res，2012，72（22）：5812-5823.

［7］Dennison JB，Molina JR，Mitra S，et al.Lactate dehydrogenase B：a metabolic marker of response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer［J］.Clin Cancer Res，2013，19（13）：3703-3713.

［8］Zha X，Wang F，Wang Y，et al.Lactate dehydrogenase B is critical for hyperactive mTOR-mediated tumorigenesis［J］.Cancer Res，2011，71（1）：13-18.

［9］Abraham J.PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitors：the ideal combination partners for breast cancer therapies？［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2015，15（1）：51-68.

［10］Aveseh M，Nikooie R，Aminaie M.Exercise-induced changes in tumour LDH-B and MCT1 expression are modulated by oestrogen-related receptor alpha in breast cancer-bearing BALB/c mice［J］.J Physiol，2015，593（12）：2635-2648.

Cloning of human lactate dehydrogenase B gene and construction of its eukaryotic expression vector*

Hu Xianglin1，Qing Xin2，Zeng Fancai2△
（1.Clinical Medical College；2.Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology，Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

ObjectiveTo clone human lactate dehydrogenase B（LDH-B）gene and to construct its eukaryotic expression vector.MethodsTotal RNA was extracted from human breast cancer cell line MDA-MB-231，cDNA was generated by reverse transcription，cDNA was used as the template and the sequence segment of LDH-B gene coding region was amplified by poly merase chain reaction（PCR），both LDH-B gene segment and pUC19 plasmid were digested with two restriction endonucleases of BamHⅠand KpnⅠ，pUC19-LDH-B cloning vector was constructed by ligation reaction and then transformed into E.coli DH5α competence cells，the single white bacterial colony was selected in the blue-white selection plates，positive recombinant plasmid was identified by double restriction endonucleases digestion and DNA sequencing.Eukaryotic expression vector of pcDNA3.1（-）-LDH-B was constructed by subcloning LDH-B gene segment with the right sequence into pcDNA3.1（-）vector.ResultsA specific DNA band about 1.0 kb was found by PCR amplification，which agreed with the expected fragment length of LDH-B；two DNA bands about 2.6 kb and 1.0 kb were seen after digestion of pUC19-LDH-B with BamHⅠand KpnⅠ，which agreed with the fragment length of pUC19 and LDH-B respectively，the LDH-B sequencing result was consistent with its reference sequence in Genebank；two DNA bands about 5.5 kb and 1.0 kb were seen after digestion of pcDNA3.1（-）-LDH-B with BamHⅠand KpnⅠ，which agreed with the fragment length of pcDNA3.1（-）and LDH-B respectively.ConclusionHuman LDH-B gene is successfully cloned in this experimental study and its eukaryotic expression vector is successfully constructed，which lays an essential foundation for further exploring LDH-B biological functions.

L-lactate dehydrogenase；Genes；Cloning，molecular；Genetic vectors；Eukaryotic cells

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.20.004

A

1009-5519（2016）20-3106-03

国家级大学生创新创业训练计划项目（201410632010）。

胡湘麟（1994-），2012级麻醉专业在读本科生。

△，E-mail：zfcai@swmu.edu.cn。

（2016-06-08）