不同抗菌药物对肺炎克雷伯菌耐药突变选择窗的影响分析

张鹏，韦红光

（1.桂林市人民医院药学部，广西541002；2.玉林市第三人民医院药剂科，广西537000）

不同抗菌药物对肺炎克雷伯菌耐药突变选择窗的影响分析

张鹏1，韦红光2

（1.桂林市人民医院药学部，广西541002；2.玉林市第三人民医院药剂科，广西537000）

目的探讨不同抗菌药物对肺炎克雷伯菌耐药突变选择窗（MSW）的影响。方法收集该院2013年4月至2014年4月分离的30株肺炎克雷伯菌的相关资料，采用琼脂倍比稀释法测定单一左氧氟沙星及左氧氟沙星联合阿米卡星的防突变浓度（MPC）及最低抑菌浓度（MIC），比较单一左氧氟沙星及左氧氟沙星联合阿米卡星对肺炎克雷伯菌的选择指数（SI）。结果左氧氟沙星联合阿米卡星的MIC为0.03～1.00 mg/L，为单一左氧氟沙星（0.01～1.00 mg/L）的50.0%，二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；左氧氟沙星联合阿米卡星的MIC90为0.250 mg/L，显著低于单一左氧氟沙星的0.500 mg/L，差异有统计学意义（P＜0.05）；2种抗菌药物的MIC50比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。左氧氟沙星联合阿米卡星的MPC为1～8 mg/L，MPC50为1 mg/L、MPC90为2 mg/L，显著低于单一左氧氟沙星的MPC（2～16 mg/L）及MPC50、MPC90（2、8 mg/L），差异均有统计学意义（P＜0.05）；单一左氧氟沙星与左氧氟沙星联合阿米卡星对肺炎克雷伯菌的SI均在2～64，其不同SI菌株的分布比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论左氧氟沙星联合阿米卡星能够降低肺炎克雷伯菌的MPC，引起左氧氟沙星对肺炎克雷伯菌的MSW变窄。

克雷伯菌，肺炎；氧氟沙星；突变；药物耐受性；阿米卡星

肺炎克雷伯菌是临床上常见的病原菌，在人类呼吸道中较常见，属于条件致病菌，可引起呼吸道感染，从而引起肺炎等疾病，影响患者的正常生活和工作。目前临床上对肺炎克雷伯菌引起的感染多以抗菌药物治疗为主，能够有效改善症状，缓解病情，但随着抗菌药物的滥用，细菌耐药性也越来越高［1］。相关实验结果表明，合理使用抗菌药物能够降低或避免药物引起的细菌耐药［2］。同时，细菌耐药突变选择窗（MSW）理论也为细菌的耐药性研究提供了新的依据和方法。但目前临床上有关不同抗菌药物对肺炎克雷伯菌耐药MSW的影响研究相对较少［3］。为此，本研究对临床分离的30株肺炎克雷伯菌的相关资料进行分析，现报道如下。

1　资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料收集本院2013年4月至2014年4月临床分离的30株肺炎克雷伯菌的相关资料进行分析，30株病原菌对左氧氟沙星及阿米卡星均敏感。肺炎克雷伯菌标准菌株（ATCC700603）购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2试剂与药物本研究所需药物、试剂批号及生产厂家等见表1。

表1　试验所需药物和试剂

1.2方法

1.2.1最低抑菌浓度（MIC）测定采用琼脂平板倍比稀释法测定MIC，测定过程中首先进行0.5 McFarland（马克法兰）浊度肺炎克雷伯菌菌悬液配制，并对其进行稀释，取2 μL菌悬液接种于含有左氧氟沙星、阿米卡星单药或2种药物联合的琼脂平板上，进行24 h孵育，温度控制在35℃，观察菌落生长情况，并记录MIC浓度［4-5］。

1.2.2防突变浓度（MPC）测定采用琼脂平板倍比稀释法测定MPC，测定过程中以第一步测定的左氧氟沙星、阿米卡星的MIC作为基准，采用二倍递增方法配制不同浓度的左氧氟沙星、左氧氟沙星联合阿米卡星的琼脂平板，每个浓度配置4个平板，为测定不同抗菌药物的MPC做好准备。同时，以测得的左氧氟沙星、阿米卡星的MPC作为基准进行稀释，并采用棋盘法对不同浓度的抗菌药物进行分配，配制成含有左氧氟沙星和阿米卡星2种药物的琼脂平板，为测定左氧氟沙星联合阿米卡星的MPC做好准备［6］。根据实验相关操作步骤［7］配制浓度为3.0×1010CFU/mL菌悬液，并取100 μL菌悬液放置在含有单药及联合药物的琼脂平板上，使得病原菌总接种量达到1.2×1010CFU。最后对病原菌进行72 h培养、孵育，温度控制在35℃，记录相关数据［8-9］。

1.3统计学处理应用SPSS16统计软件进行数据分析，计数资料以构成比表示，采用χ2检验。P＜0.05为有统计学意义。

2　结果

2.1左氧氟沙星对30株肺炎克雷伯菌的MIC左氧氟沙星联合阿米卡星的MIC为0.03～1.00 mg/L，为单一左氧氟沙星（0.01～1.00 mg/L）的50%，二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；左氧氟沙星联合阿米卡星的MIC90为0.250mg/L，明显低于单一左氧氟沙星的0.500 mg/L，差异有统计学意义（P＜0.05）；2种抗菌药物MIC50比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2　左氧氟沙星对30株肺炎克雷伯菌的MIC（mg/L）

2.2左氧氟沙星对30株肺炎克雷伯菌的MPC左氧氟沙星联合阿米卡星的MPC为1～8 mg/L，MPC50为1 mg/L、MPC90为2 mg/L，显著低于单一左氧氟沙星的上述指标，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

2.3左氧氟沙对30株肺炎克雷伯菌的选择指数（SI）单一左氧氟沙星和左氧氟沙星联合阿米卡星对30株肺炎克雷伯菌的SI均在2～64，其不同IS菌株的分布比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表3　左氧氟沙星对30株肺炎克雷伯菌的MPC（mg/L）

表4　左氧氟沙星对30株肺炎克雷伯菌不同SI的菌株分布（株）

3　讨论

肺炎克雷伯菌是临床上常见的条件致病菌，在正常人群中的带菌率约为5%，而对于住院患者而言，带菌率可达20%，是酒精中毒、糖尿病及慢性阻塞性肺疾病患者并发肺部感染的潜在危险因素［10］。患者感染后会引起肺炎、肠道感染、泌尿系统感染等。目前临床上对于肺炎克雷伯菌引起的感染多采用抗菌药物治疗为主，能够有效地控制感染。但是，药物在抑制细菌、控制感染的同时也会引起或加重细菌耐药性。传统医学认为，患者使用抗菌药物后血药浓度需要达到MIC以上才能发挥作用，显然这种观念是笼统的、不全面的。MSW相关研究结果显示，当抗菌药物浓度低于MIC时，细菌没有突变选择的能力，从而不会引起耐药突变株的选择性富集［11］。当抗菌药物浓度在病原菌MIC和MPC之间时，敏感菌株才会得到抑制，从而引起细菌发生耐药性。同时，当抗菌药物浓度高于MPC时，细菌必须含有2种或2种以上的耐药突变才能够正常生长，并且这种概率相对比较低，从而造成病原菌很难出现耐药突变体的富集［12］。本研究中左氧氟沙星联合阿米卡星后MIC为0.03～1.00 mg/L，为单一左氧氟沙星（0.01～1.00 mg/L）的一半；左氧氟沙星联合阿米卡星的MIC90为0.250mg/L，明显低于左氧氟沙星（0.500 mg/L），差异均有统计学意义（P＜0.05）；2种抗菌药物MIC50比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

MSW理论显示，肺炎克雷伯菌感染患者在选择抗菌药物时应尽可能将药物浓度缩短至MIC及MPC之间，尽可能选择窄MSW药物，必要时甚至可以采取联合用药，从而使MSW变窄或关闭，降低病原菌突变发生率。本研究中，左氧氟沙星联合阿米卡星的MPC为1～8mg/L、MPC50为1 mg/L、MPC90为2 mg/L，显著低于单一左氧氟沙星（MPC为2～16 mg/L、MPC50为2 mg/L、MPC90为8 mg/L），差异均有统计学意义（P＜0.05）。但是，目前临床上窄MSW的抗菌药物并不多，多数抗菌药物是在血药浓度及组织液浓度达到MPC时才会出现明显的毒性反应，因此，这种治疗方案在临床上比较少用甚至不使用。临床上通过抗菌药物的联合使用能够有效缩小或关闭MSW，这是临床上降低或预防病原菌耐药的一种重要方法［13］。

本研究结果显示，单一左氧氟沙星和左氧氟沙星联合阿米卡星对肺炎克雷伯菌的SI均在2～64，其不同SI菌株的分布比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。表明2种抗菌药物联合使用能够有效降低肺炎克雷伯菌的MPC，能使抗菌药物在临床上应用时的血药浓度达到MPC之上，从而更有利于防止病原菌的富集。2种抗菌药物联合使用，能够有效改善药物对病原菌的MIC和MPC，从而相应引起SI值发生变化。不同抗菌药物的联合使用更有利于血药浓度快速通过MSW，降低耐药病原菌的聚集，同时引起MSW变宽，从而引起血药浓度在MSW内的时间变长，增加了耐药突变株富集的机会。表明抗菌药物的联合应用能够有效预防耐药突变菌的富集，并且引起MSW的增快，增加病原菌的耐药突变选择性富集。因此，使用抗菌药物时应加强药敏试验，根据药敏试验结果选择针对性的抗菌药物，以提高临床治疗效果［14］。

综上所述，左氧氟沙星联合阿米卡星能够降低对肺炎克雷伯菌的MPC，使左氧氟沙星对肺炎克雷伯的MSW变窄。

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Analysis on influence of different antibacterial agents against Klebsiella pneumoniae drug resistant mutant selection window

Zhang Peng1，Wei Hongguang2
（1.Department of Pharmacy，Guilin Municipal People′s Hospital，Guilin，Guangxi 541002，China；2.Department of Pharmacy，Yulin Municipal Third People′s Hospital，Yulin，Guangxi 537000，China）

ObjectiveTo study the influence of different antibacterial drugs on Klebsiella pneumoniae drug resistant mutant selection window（MSW）.MethodsThe related data in 30 strains of Klebsiella pneumoniae in our hospital from April 2013 to April 2014 were collected.The mutant prevention concentration（MPC）and minimum inhibitory concentration（MIC）of single levofloxacin and levofloxacin combined with amikacin were detected by adopting the agar double ratio dilution method.Then their selection indexes（SI）on Klebsiella pneumoniae were compared.ResultsMIC of levofloxacin combined with amikacin was 0.03-1.00 mg/L，which was 50.0%of single levofloxacin（0.01-1.00 mg/L），the difference was statistically significant（P＜0.05）；MIC90of levofloxacin combined with amikacin was 0.250 mg/L，which was significantly lower than 0.500 mg/L of single levofloxacin，the difference was statistically significant（P＜0.05）；MIC50had no statistical difference between the two kinds of antibacterial drug（P＞0.05）.MPC of levofloxacin combined with amikacin was 1-8 mg/L，MPC50was 1 mg/L，MPC90was 2 mg/L，which were significantly lower than 2-16mg/L，2，8mg/Lof single levofloxacin，the differences were statistically significant（P＜0.05）；SI of single levofloxacin and levofloxacin combined with amikacin against Klebsiella pneumoniae was 2-64，the difference was not statistically significant（P＞0.05）.ConclusionLevofloxacin combined with amikacin can reduce MPC to Klebsiella pneumoniae and can cause levofloxacin to narrow MSW to Klebsiella pneumoniae.

Klebsiella pneumoniae；Ofloxacin；Mutation；Drug toleranc；Amikacin

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.20.009

A

1009-5519（2016）20-3122-03

张鹏（1978-），主管药师，主要从事医院药学工作。

（2016-04-18）