LIM结构域结合蛋白1在脑胶质瘤患者中的表达研究

董成亚，曹敬丽，李昊文，康熙雄，王雅杰，

（首都医科大学附属北京天坛医院，1.临床医学研究实验室，2.检验科，北京100050）

LIM结构域结合蛋白1在脑胶质瘤患者中的表达研究

董成亚1，曹敬丽1，李昊文1，康熙雄2，王雅杰1，2

（首都医科大学附属北京天坛医院，1.临床医学研究实验室，2.检验科，北京100050）

目的 观察LIM结构域结合蛋白1（LIM-domain-binding 1，Ldb1）在脑胶质瘤患者中的表达。方法 采用Real-time PCR方法检测46例脑胶质瘤手术患者脑组织、18例正常对照和16例良性脑肿瘤对照脑组织标本中Ldb1 mRNA的表达水平；采用免疫组化EnVision二步法观察Ldb1在高级别胶质瘤中的蛋白表达定位。结果 脑胶质瘤患者脑组织Ldb1的mRNA表达高于正常对照组和良性脑肿瘤对照组。Ldb1在不同分级的胶质瘤中表达并不相同，在III、IV级中的相对表达量明显高于Ⅰ、Ⅱ级（P＜0.001）。在高级别胶质瘤中，Ldb1蛋白主要表达在肿瘤细胞核和胞浆内。结论 脑胶质瘤患者肿瘤组织中Ldb1表达增高，可能参与了胶质瘤的发生、发展过程。

脑胶质瘤； Ldb1； 表达

脑胶质瘤是一种常见的原发性颅内肿瘤。根据2007年WHO中枢神经系统肿瘤的病理分类，可划分为I级［1］。其中，WHO I～II级又称为低级别胶质瘤；而WHO III～IV级称为高级别胶质瘤。近些年来，胶质瘤的诊断和治疗均取得了较大进展，但是大多数胶质瘤患者的预后仍然不太好。研究发现，一些分子标志物在胶质瘤的发生和进展过程中发挥重要作用［2］。识别新的分子标志物对于胶质瘤的诊疗具有重要意义。LIM结构域结合蛋白1（LIM-domain-binding 1，Ldb1）是生物进化过程中高度保守的一个辅助因子，广泛表达在从蠕虫到人类的胚胎组织和成体细胞中［3］。Ldb1辅因子可以与核LIM同源域蛋白（LIM homodomain protein，LIM-HD）或者单纯LIM结构域蛋白（LIM domain only，LMO）中的LIM结构域作用，形成多蛋白转录复合体，调控靶基因DNA转录［4-6］。实验表明，Ldb1在胚胎发育过程中起关键作用，Ldb1基因缺失的小鼠在胚胎发育9.5～10天死亡，与此同时，Wnt信号转导通路也被异常活化［7］。Ldb1辅因子还参与口腔鳞状细胞癌、乳腺癌和肝癌等肿瘤的发生、发展［8-10］，预示Ldb1在癌症诊断与治疗上具有一定的研究价值。我们前期工作发现，Ldb1相互作用的LMO1和LMO4在脑胶质瘤组织标本中表达上调，提示Ldb1基因可能在胶质瘤中表达异常［11］。本研究对脑胶质瘤手术患者中的Ldb1表达进行检测，观察Ldb1在胶质瘤患者脑组织中的表达情况。

对象与方法

1 研究对象

脑胶质瘤标本46例（男26例，女20例，年龄11～72岁）取自首都医科大学附属北京天坛医院2010至2013年切除的手术标本。病理分级根据WHO 2007年中枢神经系统肿瘤分类标准，其中Ⅰ级星形细胞瘤5例；Ⅱ级胶质瘤16例（星形细胞瘤3例，少枝胶质细胞瘤4例，少枝-星形细胞瘤9例）；Ⅲ级胶质瘤9例（间变性少枝胶质细胞瘤2例，间变性少枝-星形细胞瘤7例）；Ⅳ级多形性胶质母细胞瘤16例。对照组选取同期住院的需手术切除正常脑组织的脑创伤或脑皮质造瘘患者18例（男10例，女8例，年龄22～50岁），以及良性脑肿瘤（病理诊断为脑膜瘤）患者16例（男7例，女9例，年龄19～63岁）。所有组织采集后立即置于液氮中，随后-80℃低温保存备用。

2 Real-time PCR检测Ldb1基因mRNA表达

取手术组织标本加入液氮，在研钵中碾成粉末，加入TRIZOL（美国Invitrogen公司）裂解，提取总RNA，经紫外分光光度计测定浓度后，各组织标本分别取2μg RNA，使用Takara公司的逆转录试剂盒合成cDNA，反应体系及条件按照说明书进行操作。Real-time PCR引物根据在线软件Primer 3自行设计，由上海英潍捷基贸易有限公司合成。引物序列如下：Ldb1 Forward：5’-GAGGACGAGAGGCTCATCA C-3’，Reverse：5’-TTTACTGGGAGGCCTGTGA C-3’，扩增片段长度为181 bp。GAPDH Forward：5’-CCAG AACATCATCCCTGCCT-3’，Reverse：5’-CCTGCTTCA CCACCTTCTTG-3’，扩增片段长度为185 bp。所有反应均在Takara荧光定量PCR仪上进行检测，检测条件为95℃预变性5min，95℃变性5s，55℃退火20s，72℃延伸30s，反应50个循环。进行溶解曲线分析以确认PCR产物的特异性。实验重复3个副孔，取平均值。以2-ΔΔCt法计算Ldb1的相对表达量。

3 免疫组化法检测Ldb1蛋白定位

选取高级别脑胶质瘤（WHO III-IV）手术标本14例，4%中性甲醛固定，石蜡包埋，制成厚约4μm的组织切片。采用EnVision二步法进行免疫组化检测。小鼠抗人Ldb1多克隆抗体（sc-365074）购自美国Santa-Cruz公司；DAB染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件和R（v3.2.3）软件进行统计学分析。实验数据用中位数（X25%～X75%）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；多组间比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验，当P≤0.05即认为多个总体不全相同，采用R（v3.2.3）软件进行两两比较的Dunn-Bonferroni检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 Ldb1在胶质瘤、正常对照和良性脑肿瘤对照脑组织中的表达

实时定量PCR结果显示，Ldb1 mRNA在脑胶质瘤、正常对照和良性脑瘤对照中的表达量不同。进一步对胶质瘤组和对照组分别进行两两比较，结果发现Ldb1 mRNA在脑胶质瘤患者中的表达水平明显高于良性脑肿瘤对照组（P＜0.001）；Ldb1 mRNA在胶质瘤中表达较正常对照组升高，但两组间差异没有统计学意义（图1和表1）。

表1 正常对照及良性脑肿瘤对照和胶质瘤患者脑组织中Ldb1水平的比较［M（X25%～X75%）］

进一步分析不同级别脑胶质瘤中的表达时发现，高级别脑胶质瘤患者脑组织中Ldb1相对表达量高于低级别胶质瘤组，差异具有统计学意义（表2）。

表2 同病理分级胶质瘤患者脑组织中Ldb1水平的比较［M（X25%～X75%）］

2 Ldb1在高级别胶质瘤组织中的染色定位

为了观察Ldb1蛋白在胶质瘤细胞中的定位情况，我们采用免疫组化染色的方法检测了Ldb1在高级别胶质瘤脑组织内的表达。结果发现，Ldb1蛋白主要表达在肿瘤细胞核和胞浆中，肿瘤细胞胞核和胞质内可见明显浅棕黄色或棕黄色染色颗粒（见图2）。

讨 论

Ldb1属于CLIM辅助因子家族，该辅因子本身不能与DNA分子直接结合，可通过与核LIM蛋白，如LIM-HD、LMO及其它转录因子的相互作用，形成多蛋白转录复合物，调控靶基因的转录，在胚胎生长发育、细胞谱系决定等过程中具有重要的作用［4-7，12］。在中枢神经系统与神经细胞的发育过程中，Ldb1和LMO4作用于 Neurogenin 2转录因子，参与胚胎期大脑皮层的神经发生和神经元放射状迁移［13］。此外，Ldb1还可与Lhx1和Lhx5结合，形成蛋白转录复合物，调控浦肯野细胞的增殖和分化［14］。根据Ldb1在胚胎神经系统发育中发挥的重要作用，以及考虑到肿瘤发生和胚胎发育之间的密切相关性，我们推测，Ldb1辅因子在神经系统肿瘤中可能有表达并对其病理生理过程发挥作用。

我们前期研究结果发现，在脑胶质瘤手术病人标本中，Ldb1辅因子结合的核LIM蛋白LMO1和LMO4表达水平明显高于正常对照组。为了进一步明确Ldb1在中枢神经系统肿瘤中的表达情况，本研究检测了46例胶质瘤患者脑组织中的Ldb1表达水平，发现Ldb1 mRNA在神经胶质瘤组织中表达高于正常对照组和良性脑肿瘤对照组，在高级别胶质瘤中高于低级别胶质瘤患者组，提示Ldb1辅因子在胶质瘤中是一个与肿瘤恶性程度相关的癌基因。

Salmans等［10］观察到，Ldb1在不同分子亚型的乳腺癌组织中表达水平不同，是乳腺癌预后差的一个分子标志物。Johnsen等［15］报道，Ldb1可促进雌激素受体（ERα）在乳腺癌细胞中的生长促进作用。此外，Ldb1还有助于维持乳腺基底上皮细胞的干细胞特性，促进乳腺肿瘤的发生［10］。在口腔鳞状细胞癌中，免疫共沉淀实验结果发现，Ldb1和LMO4以蛋白复合体的形式共表达在肿瘤向周围组织侵袭性生长的前沿区域，尤其是在间变的肿瘤细胞和发生转移的淋巴结中高度表达［9］。在脑胶质瘤中，Ldb1和LMO1/LMO4的共同表达是否促进肿瘤的发生、发展及其作用机理值得我们深入探讨。

本文通过检测正常对照及良性脑瘤对照和胶质瘤患者脑组织中Ldb1 mRNA相对表达量，发现Ldb1 mRNA在脑胶质瘤中表达上调，并随着恶性病理分级增加而表达量增加。该实验结果为进一步深入研究Ldb1在胶质瘤中的作用及可能的机制提供了线索和理论基础。

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［10］Salmans M L，Yu Z，Watanabe K，et al.The co-factor of LIM domains（CLIM/LDB/NLI）maintains basal mammary epithelial stem cells and promotes breast tumorigenesis.PLoSGenet，2014， 10（7）：e1004520.

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（张增武编辑）

The Study of LIM-domain-binding 1 Expression in Brain of Patients with Gliomas

DONG Cheng-ya，CAO Jing-li，LIHao-wen，KANG Xi-xiong，WANG Ya-jie
（Core Laboratory for Clinical Medical Research，Department of Clinical Laboratory Diagnosis，Beijing Tiantan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China）

Objective To investigate the expression of Ldb1 in human gliomas and normal brain tissues and evaluate its clinical significance.M ethods The level of LIM-domain-binding 1（Ldb1）in brain specimens collected from 46 patients with gliomas，18 normal controls and 16 benign brain tumors was measured by quantitative real-time PCR.EnVision Immunohistochemistry technique was also applied to detect the protein expression of Ldb1 in formalin-fixed paraffin embedded samples of high-grade gliomas.Results Ldb1 expression in glioma patients was statistically higher than that in the controls.Compared with that in lowgrade gliomas，Ldb1 mRNA levels in high-grade gliomas were significantly increased（P＜0.001）.Ldb1 protein was localized in nucleus and cytoplasmin human high-grade glioma cells.Conclusion The expression of Ldb1 is elevated in glioma cells.Itmay be related to the occurrence and development of glioma.

Glioma； Ldb1； Expression

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.06.001

2016-02-24；

2016-04-28

首都医科大学附属北京天坛医院青年科研基金（2013年度）；脑肿瘤北京市重点实验室2014年开放课题（2014NZLY01）；国家自然科学基金（81572474）；北京市中医药科技发展资金项目（JJ2015-14）

王雅杰。E-mail：tiantanwyj@aliyun.com