胆翘注射液体内外抗炎作用的研究

吴建华，黄宏业，杨善忠 ，何家康，陶 卿，付远妨 ，胡庭俊

（1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2.广西北斗星动物保健品有限公司，广西 南宁 530003）

胆翘注射液体内外抗炎作用的研究

吴建华1，黄宏业2，杨善忠2，何家康1，陶 卿2，付远妨1，胡庭俊1

（1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2.广西北斗星动物保健品有限公司，广西 南宁 530003）

通过建立二甲苯致小鼠耳肿胀的炎症模型和LPS刺激RAW264.7细胞致炎模型，分别研究胆翘注射液的体内外抗炎作用。体内抗炎试验结果表明，0.025、0.05、0.1 g/（kg·BW）的胆翘注射液能够显著降低模型小鼠的耳肿胀率（P＜0.01）和血清 IL-1β、IL-8、TNF-α 含量（P＜0.05）；体外抗炎试验结果表明，25、50、100μg/mL的胆翘注射液对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌促炎因子TNF-α、IL-1β水平具有显著的抑制作用（P＜0.05）。综上提示，胆翘注射液具有较好的体内外抗炎作用。

胆翘注射液；小鼠；炎症模型；巨噬细胞；抗炎作用

炎症是机体组织对各种致炎因子及局部损伤所产生的以血管渗出为中心，以防御为主的应答性反应，表现为红、肿、热、痛和机能障碍。当机体局部组织受到致炎因子的作用时，会发生一系列复杂的炎症反应，局部组织细胞释放出大量的炎症介质，产生变质、渗出和增生等病理变化，其结局通常取决于机体的抵抗力和反应力。抗炎药物可以缓解炎症的病理变化，抑制炎症的发展，因此在临床治疗中显得尤为重要。如糖皮质激素类药物地塞米松是临床常用的抗炎药物，对于肺炎、关节炎、不完全痊愈的肉芽组织增生等许多炎症都有良好的抗炎效果［1-3］。中药是我国传统医学的重要组成部分，近年来，大量研究报道许多中药的有效成分具有抗炎作用，如黄连小檗碱、黄芩苷、川芎嗪、连翘酚、连翘甙等有效成分具有很好的抗炎作用［4-7］，具有临床应用的潜力。胆翘注射液由广西北斗星动物保健品有限公司自主研制，主要成分为黄芩苷和胆酸。该研究旨在通过评价胆翘注射液对小鼠的体内外抗炎作用，为该制剂的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物与细胞：健康昆明种小鼠，SPF级，雌雄各半，平均体重18～22 g，购于广西医科大学动物实验中心，试验前预饲养7 d。小鼠RAW264.7巨噬细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞研究所。

1.1.2 药品与试剂：胆翘注射液，广西北斗星动物保健品有限公司提供；二甲苯，广东光华科技股份有限公司生产；地塞米松磷酸钠注射液，贵州天地药业有限责任公司生产；脂多糖，MTT，DMSO（Sigma）；DMEM 高糖培养液 （Gbico）， 胎牛血清（Gbico）；小鼠 TNF-α、IL-1β、IL-8、NO ELISA 试剂盒购自深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器：0114型打孔器，宁波得力公司生产；MCO-5AC二氧化碳培养箱，日本三洋株式会社生产；光学显微镜，日本尼康公司生产；超净工作台，苏净安泰公司生产；168-1130型酶标仪，美国BIO-RAD公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 体内抗炎试验：取体重为18～22 g的清洁级昆明种健康小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。空白对照组小鼠腹腔注射生理盐水0.5mL/只；药物对照组小鼠按照 25 mg/（kg·BW）的剂量腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液；3个药物处理组小鼠分别腹腔注射剂量为 0.025、0.05、0.1 g/（kg·BW）的胆翘注射液。各组小鼠均连续给药3 d。

小鼠给药前及致炎前各称体重1次。于最后一次给药后1 h，所有实验小鼠左耳两面涂抹0.05mL二甲苯致炎，右耳作为对照不作处理。致炎后30min对小鼠进行眼球采血，分离血清，测定血清中的炎症因子IL-1β、IL-8、TNF-α和NO水平。然后将小鼠颈椎脱臼处死，用直径6mm的打孔器在左右两耳的同一部位打下耳片，立即用电子天平称量两耳片重量，计算耳肿胀度、耳肿胀率和耳肿胀抑制率。解剖小鼠，取肝脏、肾脏、脾脏、胸腺称重，计算脏器指数。具体计算方法如下。

耳肿胀度=左耳重量-右耳重量

耳肿胀率=耳肿胀度/右耳重量×100%

耳肿胀抑制率=（空白对照组平均肿胀度-药物处理组平均肿胀度）/空白对照组肿胀度×100%

肝脏指数=肝脏重量（mg）/小鼠体重（g）

肾脏指数=肾脏重量（mg）/小鼠体重（g）

脾脏指数=脾脏重量（mg）/小鼠体重（g）

胸腺指数=胸腺重量（mg）/小鼠体重（g）

1.2.2 体外抗炎试验

1.2.2.1 MTT法测定胆翘注射液对RAW264.7细胞的安全浓度：设空白对照组和7个药物处理组（800、400、200、100、50、25、12.5μg/mL）， 每组设 6个平行孔。RAW264.7细胞置于DMEM高糖完全培养液（含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素）中生长。取对数生长期细胞接种于96孔培养板中，调整浓度为4×105个/mL，每孔100 μL，预贴壁培养1 h。吸弃上清液，药物处理组分别加入稀释好的各浓度胆翘注射液100 μL/孔，空白对照组补足培养液，37℃、5%CO2培养24 h。 每孔加入 20 μL MTT （5 mg/mL），混匀，继续培养4 h。吸弃上清液，每孔加入100 μL DMSO，漩涡混匀，静置10min，用酶标仪测定OD490nm值。

1.2.2.2 胆翘注射液对LPS诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响：试验设8个组，分别为空白对照组、LPS 对照组 （LPS 10μg/mL）、LPS （LPS 10μg/mL）+3个胆翘注射液剂量组 （胆翘注射液终浓度分别为 25、50、100μg/mL）、3 个胆翘注射液对照组。每组4孔，做3次重复试验。

取对数生长期RAW264.7细胞，调整细胞浓度为5×106个/mL，接种于24孔培养板中，每孔500μL。细胞贴壁后，吸弃上清液，胆翘注射液处理组加入各浓度胆翘注射液1000 μL。处理1 h后，LPS组加入 LPS（终浓度为 10μg/mL）处理，培养 24 h。 培养结束后，收集细胞上清液分装于0.5mL EP管中，-20℃冻存。严格按照试剂盒说明书用ELISA法检测上清液细胞因子含量。

2 结果与分析

2.1 体内抗炎试验

2.1.1 胆翘注射液对致炎小鼠脏器指数的影响：由表1可知，0.1 g/（kg·BW）胆翘注射液组和地塞米松组的肝脏指数显著高于空白对照组（P＜0.05）；胆翘注射液各给药组的肾脏指数与空白对照组和地塞米松组的差异均不显著（P＞0.05）；地塞米松组的胸腺指数显著低于空白对照组（P＜0.05），各给药组的胸腺指数与空白对照组和地塞米松组的差异均不显著（P＞0.05）；地塞米松组的脾脏指数极显著低于空白对照组（P＜0.01），0.025 g/（kg·BW）胆翘注射液组的脾脏指数显著低于空白对照组（P＜0.05）；各给药组及空白对照组的脾脏指数均极显著高于地塞米松组（P＜0.01）。

2.1.2 胆翘注射液对小鼠耳廓肿胀的影响：由表2可知，地塞米松组和胆翘注射液各给药组的耳肿胀率均极显著低于空白对照组（P＜0.01）。

表1 胆翘注射液对致炎小鼠脏器指数的影响 mg/g

表2 胆翘注射液对致炎小鼠耳肿胀率及耳肿胀抑制率的影响 %

表3 胆翘注射液对小鼠血清中炎症因子水平的影响

表4 胆翘注射液对RAW264.7细胞存活率的影响

2.1.3 胆翘注射液对小鼠血清中炎症因子水平的影响：由表3可知，胆翘注射液各给药组的小鼠血清炎症因子 IL-1β、IL-8、TNF-α 水平均显著低于空白对照组（P＜0.05），但NO水平与空白对照组相比差异不显著（P＞0.05）；地塞米松组小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-8、TNF-α水平均极显著低于空白对照组 （P＜0.01），NO水平极显著高于空白对照组（P＜0.01）。

2.2 体外抗炎试验

2.2.1 胆翘注射液对RAW264.7细胞活性的影响：由表4可知，用不同浓度的胆翘注射液处理RAW264.7 细胞 24 h 后，200、400μg/mL 的胆翘注射液显著下调细胞活性 （P＜0.05），800μg/mL 的胆翘注射液能使细胞活性极显著下降（P＜0.01）。结果表明，小于或等于100μg/mL的胆翘注射液对RAW264.7细胞的生长无抑制作用，因此，选择25、50、100μg/mL的剂量作为下一步研究胆翘注射液体外抗炎作用的用药剂量。

2.2.2 胆翘注射液对LPS诱导RAW264.7细胞分泌促炎细胞因子的调节作用：由表5可知，经LPS刺激24 h后，RAW264.7细胞分泌的TNF-α、IL-1β水平升高，与空白对照组相比差异极显著 （P＜0.01），但IL-8水平和NO水平与空白对照组相比差异不显著（P＞0.05）；各剂量的胆翘注射液均能够显著抑制由LPS刺激引起的TNF-α、IL-1β的大量分泌（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 胆翘注射液的体内抗炎效果 该研究通过建立二甲苯致小鼠耳肿胀模型，探讨胆翘注射液对小鼠的体内抗炎效果。由各组脏器指数可以看出，地塞米松和胆翘注射液对小鼠的肾脏指数无显著影响。胆翘注射液高剂量组的肝脏指数较空白对照组显著升高，表明高剂量的胆翘注射液可能对小鼠肝脏存在一定的影响。胆翘注射液给药组的胸腺指数与空白对照组相比无显著差异，表明胆翘注射液对小鼠胸腺无不良影响。胆翘注射液能够显著降低模型小鼠的耳肿胀率，提示胆翘注射液具有较好的体内抗炎作用，并且从试验结果来看，0.05 g/（kg·BW）胆翘注射液的抗炎效果优于其他2个剂量。

有研究表明，IL-1β、IL-8、TNF-α 等炎症细胞因子的过多释放是导致炎症的重要原因［8］。黄芩苷可以抑制由LPS诱导的腹腔巨噬细胞PGE2合成、COX-2酶活性及COX-2蛋白表达，抑制ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞p38蛋白磷酸化，并且可抑制角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀及醋酸诱导的小鼠扭体反应［9］，并对TNF-α和IL-8均有一定的调节作用，能够降低 TNF-α 和 IL-8的致炎作用［6］。 IL-8具有活化中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞的作用，使被激活的中性粒细胞合成并释放IL-8、TNF-α等细胞因子和炎症介质［10］，进而形成相互促进的关系。胆翘注射液为复方制剂，其主要成分为黄芩苷和胆酸。从该研究中小鼠血清炎症因子水平变化来看，胆翘注射液能够显著降低小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-8、TNF-α水平，起到减缓炎症反应发生的作用。

表5 胆翘注射液对LPS诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子的调节作用

3.2 胆翘注射液的体外抗炎试验 巨噬细胞系是体内启动炎症介质产生的中心细胞，也是调控炎症反应的主要细胞。在引起炎症发生的诸多诱因中，LPS是激发炎症反应的一种很重要的触发剂，LPS能够刺激体内多种细胞特别是巨噬细胞合成和释放众多内源性生物活性因子，导致全身性炎症反应的发生。RAW264.7细胞作为一种巨噬细胞，参与机体免疫过程，特别是受到LPS等外界干扰后能够产生炎症介质，启动抵抗功能，抑制炎症发生。当细胞炎症通路被激活后，产生大量的细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-8、COX-2和iNOS 等， 是炎症的重要标志 物［11］。该研究通过建立体外LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞体外炎症模型，揭示了胆翘注射液对RAW264.7细胞的体外抗炎作用。结果表明，25、50、100μg/mL 的胆翘注射液能够抑制LPS诱导RAW264.7细胞分泌促炎细胞因子TNF-α、IL-1β，表明胆翘注射液具有抑制促炎介质产生的作用。MTT试验证明，在25～100μg/mL的浓度范围内，胆翘注射液对RAW264.7细胞活力无显著影响，表明其抑制炎性介质释放作用与细胞毒性作用无关。

4 结论

胆翘注射液在小鼠体内具有较好的抗炎作用。胆翘注射液对RAW264.7细胞的安全浓度为25～100μg/mL；在安全浓度范围内，胆翘注射液（25、50、100μg/mL）能够通过抑制 RAW264.7 细胞分泌促炎细胞因子TNF-α、IL-1β，从而发挥抑制炎症反应的作用。

［1］黄燕，倪娜，路聪哲，等.低氧对人肺泡上皮细胞糖皮质激素受体表达及对地塞米松抗炎效应的影响［J］.细胞与分子免疫学杂志，2013，29（1）：39-41.

［2］母传贤，刘国玲，田华，等.川芎嗪对胶原性关节炎大鼠血清IL-1、IL-6、IL-2水平及关节浸液 NO、PGE2的影响［J］.中国中西医结合杂志，2014（2）：214-217.

［3］全东琴，崔光华，董华进，等.醋酸地塞米松静注乳剂的抗炎活性及动物组织分布研究［J］.中国药学杂志，2002，37（8）：591-594.

［4］杨剑，牛晓艺，谭红连，等.“三黄连”合剂抗炎作用研究［J］.动物医学进展，2015，36（6）：74-81.

［5］杨斌，丘岳，王柳萍，等.广西山银花绿原酸体外抗炎作用及分子机制研究 ［J］.中国药理学通报，2009，25（4）：542-545.

［6］周必英，周泠.黄芩苷对卡氏肺孢子虫肺炎大鼠TNF-α 和 IL-8 影响［J］. 中国公共卫生，2009，25（10）：1250-1251.

［7］况玲，郭庆勇，武聚富，等.金银花、连翘对成纤维上皮细胞炎症反应模型的作用［J］.现代中西医结合杂志，2008，17（34）：5275-5277.

［8］LIN C Y，LEE C H，CHANG Y W，et al.Pheophytin a inhibits inflammation via suppression of LPS-induced nitric oxide synthase -2，prostaglandin E2，and interleukin-1β of macrophages［J］.Int Jmol Sci，2014，15（12）：22819-22834.

［9］朱伟，孙红光，朱迅.黄芩苷元对炎症反应的影响［J］.中国药理学通报，2009，25（2）：194-197.

［10］张朝宁，吴立文，孙杰，等.益肾通肺汤对COPD大鼠血清IL-8、TNF-α 的影响 ［J］.甘肃中医学院学报，2006，23（1）：23-25.

［11］LI W，ZHAO Y，XU X，et al.Rebamipide suppresses TNF-α mediated inflammationin vitroand attenuates the severity of dermatitis in mice［J］.FEBS J，2015，282（12）：2317-2326.

Anti-inflammatory Effects of Danqiao Injection in Mice in Vitro and in Vivo

WU Jian-hua1，HUANG Hong-ye2，YANG Shan-zhong2，HE Jia-kang1，TAO Qing2，FU Yuan-fang1，HU Ting-jun1

（1.College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China；2.Guangxi Beidouxing Animal Health Products Co.，Ltd.，Nanning 530003，China）

This study was aimed to assess the anti-inflammatory effects of Danqiao injectionin vivoandin vitroby using the animal inflammatory model of ear edema induced by xylene in mice and the cell inflammatory model of RAW264.7 cell simulated by LPS.Thein vivoexperiment results revealed that the 0.025,0.05,and 0.1 mg/ （kg·BW） of Danqiao injection significantly reduced the ear edema rate （P＜0.01）and serum content of IL-1β,IL-8 and TNF-α （P＜0.05） of the model mice.Thein vitroexperiment results showed that the 25,50 and 100μg/mL of Danqiao injection significantly reduced the increased serum content of TNF-α and IL-1β of RAW264.7 cell induced by LPS.The combined data suggest that the Danqiao injection has good antiinflammatory effectsin vivoandin vitro.

Danqiao injection；mice；inflammatory model；macrophage；anti-inflammatory action

S859.794；S853.74

A文章顺序编号：1672-5190（2016）08-0001-04

2016-07-20

项目来源：南宁市科学研究与技术开发计划项目（20143328）。

吴建华（1986—），男，硕士研究生，主要研究方向为中药免疫药理学。

胡庭俊（1965—），男，教授，博士，博士生导师，主要从事中兽药开发与研究工作。

（责任编辑：赵俊利）