贮存温度对液体乳糖酶活性的影响

金 磊，王彦平，刘亚鹏，杜 阳

（内蒙古乳业技术研究院有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

贮存温度对液体乳糖酶活性的影响

金 磊，王彦平，刘亚鹏，杜 阳

（内蒙古乳业技术研究院有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

乳糖酶，别名β-半乳糖苷酶，主要应用于乳品行业，其主要作用是使乳糖水解为葡萄糖和半乳糖。由于乳糖酶存在受热降解的特性，在对其进行贮存的过程中，乳糖酶的活性会随贮存温度的变化而变化。对不同温度条件下贮存的液体乳糖酶活性进行了对比检测与分析。

乳糖酶；活性；温度；检测

乳糖酶也称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，简称β-半乳糖苷酶。乳糖酶可以水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖的混合物［1-2］。目前，乳糖酶广泛应用于乳品行业，特别是在牛乳中添加乳糖酶可以水解乳糖，解决乳糖不耐症，增加牛奶的营养价值和有效利用率。由于乳糖酶是一种热敏物质，贮存温度对乳糖酶的活力存在一定影响，进而会影响到产品中乳糖水解的效率，因此，贮存温度对乳糖酶的活力至关重要。为此，该研究对不同温度条件下贮存的液体乳糖酶进行了对比检测与分析。但是，目前国内还没有乳糖酶产品的检验标准方法，笔者参考国际标准（FCC8）的测定方法，对液体乳糖酶的活力值进行了测定［3-8］。

1 试验方法

1.1 研究任务 通过对5、20、37℃3种不同贮存温度的乳糖酶进行酶活检测，进而对检测结果进行对比与考察。最终得出，不同贮存温度对液体乳糖酶的活力值会产生不同程度的影响。

1.2 样品、试剂与仪器

1.2.1 样品与试剂：乳糖酶，无水磷酸二氢钾、三水合磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、乙二胺四乙酸（EDTA）、邻硝基苯酚、邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）。

1.2.2 仪器：紫外分光光度计，精密电子天平，HH-4数显恒温水浴锅，pH计。

1.3 试剂制备

1.3.1 缓冲溶液：称取8.8g无水磷酸二氢钾，8.0g三水合磷酸氢二钾，246.5 mg七水合硫酸镁和18.6 mg EDTA溶解在800 mL超纯水中，转入1 000 mL的容量瓶，用超纯水定容并摇匀，缓冲溶液的pH值为6.45～6.55（如不在该范围内，可用磷酸或氢氧化钾水溶液进行调整）。

1.3.2 ONPG底物溶液：将250.0 mg ONPG溶解在80 mL反应缓冲液中，接着转移到100 mL容量瓶中，用缓冲溶液定容，摇匀。最早在培养开始前2 h制备底物。

1.3.3 碳酸钠溶液：将50 g碳酸钠和37.2 g二水EDTA溶解在900 mL的水中，转移到1 000 mL的容量瓶中并定容到刻度。

1.3.4 邻硝基苯酚标准储备液：称取138.0～140.0 mg的邻硝基苯酚（精确到0.1 mg），用10 mL 96%的乙醇溶解后，转移至1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容并摇匀。

1.4 测定步骤

1.4.1 标准曲线的绘制：分别移取邻硝基苯酚储备液2、4、6、8、10、12、14 mL到100 mL的容量瓶中，分别加入25 mL碳酸钠溶液，再用缓冲溶液定容至刻度，摇匀，这样溶液中邻硝基苯酚所对应的浓度分别为 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mmol/L。用紫外分光光度计，在420 nm处测定每个稀释液的吸光度，用超纯水校零。

1.4.2 样品稀释液的制备：移取适量样品，用缓冲溶液溶解后，转移至合适的容量瓶中并定容，利用待检样品的默认活力值来进行稀释因子的推算，使得稀释后溶液中含有0.025～0.100 NLU/mL的活力值。

1.4.3 样品培养与检测：取最终浓度的样品液1 mL加入至合适的试管中，从t=0 min开始，按照样品标记的顺序，以相同的顺序、相同的时间间隔将加有1 mL样品的样品管放入（30±0.1）℃水浴中；从t= 5 min开始，按照相同的样品顺序和相同的时间间隔，在 （30±0.1）℃水浴中用移液枪加入 5.0 mL ONPG底物，混合后再次放入水浴中；从t=15 min开始，按照相同的样品顺序和相同的时间间隔，用移液枪加入2.0 mL碳酸钠溶液并快速混合均匀，并终止培养。最后，在30 min内，用紫外分光光度计在420 nm处测定每个稀释后样品的吸光度，仪器用超纯水校零。

1.4.4 空白样品的制备：先用移液枪移取1mL缓冲溶液至空试管中，接下来再用移液枪先后加入2.0 mL碳酸钠溶液和5.0 mL ONPG底物，搅拌（空白样品的制备可以与1.4.3操作同时进行）。在30 min内，用紫外分光光度计在420 nm处测定每个稀释后样品的吸光度，仪器用超纯水校零。

1.5 结果计算

1.5.1 摩尔吸光系数（E）：以吸光值和ONPG浓度绘制曲线，该曲线应为能过原点的直线。

摩尔吸光系数的计算公式：

E=A×139.0/（W×C）

式中：A为样品吸光度；W为邻硝基苯酚的质量，mg；C为初始样品量相当于139.0 mg时邻硝基苯酚溶液的浓度（mmol/mL）。

分别计算7种不同浓度下的邻硝基苯酚溶液的摩尔吸光系数，最终求得平均值，该数值应当在（4.6±0.1）范围内。

1.5.2 活力值计算

酶活力计算公式：酶活力（NLU/mL）=A×8×f/E× 10×1.30

式中：A为样品吸光度；8为总的最终体积，mL；f为待测乳糖酶溶液的稀释倍数；E为邻硝基苯酚摩尔吸光系数；10为培养时间，min；1.30为在单位定义中所用因子。

2 试验过程及数据分析

以ONPG为反应底物，在一定反应条件下水解10 min，生成邻硝基苯酚和半乳糖，邻硝基苯酚在420 nm处有特异性吸收，与标准曲线比较后定量。

2.1 标准曲线的制定 按照1.4.1的方法绘制标准曲线，以稀释液的吸光度对邻硝基苯酚的物质的量浓度做标准曲线。试验结果见表1。

表1 不同浓度邻硝基苯酚在420 nm处的吸收值

该标准曲线为通过原点的一条直线，方程为y=4.5845x+0.0006，相关系数R2=1.000。由图1可以看出，该标准曲线满足了必须为通过原点的一条直线的要求。

图1 邻硝基苯酚摩尔吸光系数标准曲线

根据上文给出的摩尔吸光系数的计算公式，可以计算出表1中7个摩尔吸光系数的平均值为= 4.60。

该方法中，通过连续 4次对邻硝基苯酚在420 nm处的吸光值进行测定，并计算其摩尔吸光系数的平均值（邻硝基苯酚的值变化见表2）。

表2 测定得到的邻硝基苯酚的平均摩尔吸光系数

由表2可以看出，邻硝基苯酚的E值变化很小，该值大小可能与配制标准溶液中所用到的试剂、溶剂以及仪器性能有关，该值满足检测方法中对值的要求，对试验结果不会有显著影响。

2.2 酶活力测试结果数据 对5、20、37℃3种贮存温度条件下的液体乳糖酶进行了7个月贮存期的活力值考察。所检测得到的乳糖酶活力值数据见表3、表4和表5。

2.3 酶活力测试结果数据对比 3种温度贮存乳糖酶的活力数据对比情况见图2。

表3 乳糖酶贮存条件为5℃时测得的乳糖酶活力值

表4 乳糖酶贮存条件为20℃时测得的乳糖酶活力值

表5 乳糖酶贮存条件为37℃时测得的乳糖酶活力值

图2 不同温度贮存液体乳糖酶活力值衰减趋势

3 结论

①乳糖酶的贮存温度与乳糖酶活力值有直接相关性。②在不同温度贮存条件下贮存的乳糖酶，贮存温度较低的乳糖酶其活力值在贮存期间无显著变化；贮存温度较高的乳糖酶，其活力值在贮存期间存在显著变化。③该试验结果表明，温度较高环境下贮存液体乳糖酶，其活力衰减很快；温度较低环境下贮存液体乳糖酶，其活力衰减慢且少。因此，对乳糖酶进行冷藏贮存比较好且有必要。

［1］赵华梅，王曼霞，牟志春，等.乳糖酶制剂活力测定方法的研究［J］.食品科技，2010，35（4）：240-243，246.

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［3］王睿，刘桂超.论我国酶制剂工业的发展［J］.畜牧与饲料科学，2011，32（1）：68-69.

［4］范友华，黄军，陈泽君.固定化酶载体的研究现状及其应用［J］.湖南林业科技，2007，34（2）：29-31.

［5］闫亚丽，王昌禄，刘会娟，等.透性化细胞乳糖酶与提纯的乳糖酶酶学性质比较［J］.食品科学，2008，29（10）：436-439.

［6］姜泓海，邹汉法.固定化酶微升反应器与MALDI-TOF MS联用技术用于蛋白质肽谱研究［J］.中国科学（B辑），2000，30（5）：385-391.

［7］孙国庆，石玉东，付治军，等.乳糖酶在生产低乳糖奶中的应用研究［J］.食品与机械，2008，24（2）：128-130.

［8］段文娟，杨娇艳，李卓夫，等.来源于嗜热古细菌Pyrococcus furiosus乳糖酶基因的原核表达及酶学性质分析［J］.中国农业科技导报，2008，10（2）：76-81.

Effect of Storage Temperature on Liquid Lactase Activity

JIN Lei，WANG Yan-ping，LIU Ya-peng，DU Yang
（Inner Mongolia Dairy Technology Research Institute Co.，Ltd.，Hohhot010110，China）

Lactase,also called β-galactosidase,is able to hydrolyze lactose into glucose and galactose and is mainly applied in dairy industry.Because lactase possesses the characteristic of thermal degradation,its activity is prone to change with the variation of storage temperature during the storage process.The activity of liquid lactase under different storage temperature were compared and analyzed.

lactose；activity；temperature；determination

Q55；TS252

A文章顺序编号：1672-5190（2016）09-0019-03

2016-07-26

项目来源：内蒙古自治区2013年科技重大专项（乳品生产全产业链新技术集成应用及高端乳制品的研究开发）。

金磊（1977—），男，助理工程师，主要研究方向为食品加工与安全。

（责任编辑：慕宗杰）