崂山奶山羊胎儿骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养及成神经诱导分化

杨培培，程 明，2，王学梅，刘萌萌，张 倩 ，戴正浩，刘宗正，2

（1.青岛市畜牧兽医研究所，山东 青岛 266100；2.青岛奥特种羊场，山东 青岛 266100）

崂山奶山羊胎儿骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养及成神经诱导分化

杨培培1，程 明1，2，王学梅1，刘萌萌1，张 倩1，戴正浩1，刘宗正1，2

（1.青岛市畜牧兽医研究所，山东 青岛 266100；2.青岛奥特种羊场，山东 青岛 266100）

旨在建立崂山奶山羊胎儿骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法，并研究其生物学特性和成神经分化的能力。取怀孕3个月的崂山奶山羊胎儿股骨，分离培养骨髓间充质干细胞，并进行传代培养，测定其细胞倍增时间，利用RT-PCR技术检测Oct4、Nanog、Sox2基因的表达；取P3 BMSCs分别向成神经细胞进行诱导分化，并从组织学水平和基因水平进行鉴定。结果表明，分离得到的胎儿骨髓间充质干细胞大小较为均匀，呈梭形的成纤维细胞样，可表达Oct4、Nanog、Sox2基因；传代接种后第4天进入指数生长期，第8天进入平台期，前10代BMSCs的平均倍增时间为29.7 h；P3 BMSCs成神经诱导后，尼氏体经甲苯胺蓝染色后可见紫蓝色，其特异性表达基因ENO2和GFAP表达呈阳性。获得的崂山奶山羊BMSCs具有成神经分化潜能。

崂山奶山羊；胎儿；骨髓间充质干细胞；诱导分化

体细胞克隆技术是一种现代动物育种的常用技术，而供体细胞的选择关系到动物克隆的成败和效率。目前，大部分研究使用的供体细胞均为胎儿成纤维细胞，并且获得了较高的克隆效率［1］，但近年来，应用成体干细胞作为供体细胞的研究逐渐占据了供体细胞研究的热点位置［2］。研究表明，利用猪骨髓间充质干细胞 （bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）作为供体细胞进行体外胚胎发育研究，克隆胚胎内细胞团的形成率（0.38%）远高于胎儿成纤维细胞（0.18%），囊胚凋亡率（4.6%）低于胎儿成纤维细胞（7.3%）［3］。该研究旨在通过初步建立胎儿BMSCs体外培养体系，研究其基础的生物学特性和分化能力，为筛选可用于崂山奶山羊克隆的供体细胞提供科学依据，同时也为提高崂山奶山羊BMSCs作为供体细胞的效率进行基础性探索。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物：怀孕3个月的崂山奶山羊，由青岛奥特种羊场提供。

1.1.2 主要试剂：Taq酶 （TaKaRa），胎牛血清（Sigma），DMEM-F12（Hyclone），pEASY-T1 Simple Cloning Kit（TransGen），RNAiso Plus（TaKaRa），BME（上海生工），PrimeScript®1stStrand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）。

1.1.3 目的基因的引物序列：根据NCBI中已经公布的山羊相关的基因序列，利用Primer Premier 5.0设计RT-PCR引物。相关引物序列见表1。

表1 相关基因的引物序列

1.2 试验方法

1.2.1 崂山奶山羊胎儿BMSCs的分离与培养：取怀孕3个月的崂山奶山羊，手术剖腹取出胎儿，用含双抗的PBS缓冲液浸泡、冲洗2次，剪下后腿，移入超净台内，利用无菌纱布钝性除肉，剔除腿部肌肉，取股骨部分再次用PBS冲洗干净。去掉股骨两端，用生理盐水冲洗骨髓腔，收集骨髓，1 500 r/min离心10 min，将下层沉淀细胞重悬后移入干净离心管中，DMEM-F12冲洗2～3次，吸取完全培养基（DMEM-F12+10%FBS）2 mL加入离心管中轻轻吹打，重悬细胞，计数细胞，调整细胞浓度至1×105个/mL，取1 mL接种于10 cm培养皿中，加入4 mL完全培养基，使细胞均匀散布于平皿内，放置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，3 h后半量换液，6 h后轻轻晃动培养皿，全量换液，之后每2～3 d换1次液，待细胞生长至瓶底80%～90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3比例传代培养。

1.2.2 崂山奶山羊胎儿BMSCs的干细胞因子的RT-PCR鉴定：取P3 BMSCs，弃掉培养基，PBS冲洗2次后，使用RNAiso Plus试剂盒提取总RNA，利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，利用RTPCR技术对干细胞因子Oct4、Sox2和Nanog基因表达进行检测。

1.2.3 崂山奶山羊胎儿BMSCs生长曲线的绘制：将BMSCs P1、P5、P10细胞用0.25%胰酶消化后用基础培养基进行重悬，制成单细胞悬液，接种于24孔板中，平均每孔数量为1×104个，以3孔为1组，共设置10组，每天取1组计数细胞，取平均值，以时间为横坐标，细胞数量变化为纵坐标，绘制生长曲线。同时计算细胞群体倍增时间（population doubling time，PDT），计算公式为：PDT=Tlg2/lg（Nt/ No），其中，T为起始与终止时间差，Nt为终止细胞数，No为接种细胞数。

1.2.4 崂山奶山羊胎儿BMSCs向神经细胞的诱导分化及鉴定：将BMSCs P3细胞用0.25%胰酶消化后，按2×105个/mL密度接种在6孔培养板中，在细胞生长至约 70%～80%汇合时，更换预诱导液（DMEM-F12+10%FBS+1 mmol/L β-巯基乙醇），预诱导24 h后，弃去预诱导液，更换为正式诱导液（DMEM-F12+5 mmol/L β-巯基乙醇），正式诱导24 h后，弃掉诱导液，PBS冲洗2次后用甲苯胺蓝进行染色，倒置显微镜下观察染色结果；以正常培养的细胞作为对照。利用RT-PCR技术对神经细胞特异性表达基因ENO2和GFAP进行检测。

2 结果与分析

2.1 崂山奶山羊胎儿BMSCs的分离与培养 崂山奶山羊胎儿BMSCs接种后，细胞形态多为单个大小不一的圆形细胞并悬浮于培养液中，周围混杂有大量红细胞。6 h全量换液后，可见细胞已经贴壁，但形态极其不规则，细胞形态延伸。24 h后贴壁细胞数量逐渐增多，且细胞形态多呈长梭形，培养7～8 d后，细胞逐渐融合成片状 （见图1A）。用0.25%胰酶消化并传代2～3次，显微镜下可观察到长梭形且形态一致的细胞，且伴有圆形细胞。传代细胞在培养4～5 d后达到约80%汇合（见图1B）。

2.2 崂山奶山羊胎儿BMSCs的干细胞表达基因的RT-PCR鉴定 利用电泳技术对提取的P3 BMSCs的RNA进行电泳后，可见明显的28、18、5 S共3条亮带（见图2A）。利用RT-PCR技术对干细胞多能性因子Oct4、Sox2和Nanog基因进行扩增，电泳后可见清晰的表达条带（图2B）。

图1 崂山奶山羊胎儿BMSCs原代及P3细胞培养结果（100×）

图2 崂山奶山羊胎儿BMSCs的RNA提取及干细胞多能性因子电泳结果

2.3 崂山奶山羊胎儿BMSCs生长曲线的绘制将24孔板中的BMSCs计数后绘制的生长曲线呈“S”型（见图3）。通过生长曲线可见，P1、P5、P10的生长曲线形态差别不大，线型基本一致，反映了这3个不同代次的细胞生长速率基本相同，即1～2 d时细胞均处于潜伏期，此时，生长速度一般较慢；3 d后细胞开始进入快速增长期，即对数生长期；7～8 d以后细胞的增殖速度趋缓，细胞生长进入平台期。P5细胞在3个不同代次的细胞中生长较旺盛。利用细胞倍增时间公式计算，崂山奶山羊BMSCs倍增时间平均为29.7 h。

图3 崂山奶山羊胎儿BMSCs生长曲线

2.4 崂山奶山羊胎儿BMSCs向神经细胞的诱导分化及鉴定 BMSCs经1 mmol/L β-巯基乙醇预诱导24 h后，显微镜下观察细胞形态没有明显的改变。但用5 mmol/L β-巯基乙醇正式诱导3 h后，长梭形的BMSCs胞体开始收缩变圆，胞体的折光性增强，诱导12 h后收缩变圆的胞体开始形成突起并向外延伸，部分细胞末端出现分叉，尖端膨大，部分膨大末端可与其他细胞胞体或突起接触，形似神经触突结构（见图4A）。诱导24 h后，显微镜下观察细胞形态出现双极形、多极形和锥形，部分突起末端出现次级分叉，形成类似神经元细胞的形态，并且部分细胞相互交织连接。利用甲苯胺蓝染色后在细胞中可见深蓝色颗粒或斑块状尼氏体出现，细胞核染色呈紫蓝色 （见图4B）。其特异性表达基因ENO2和GFAP经RT-PCR检测，电泳后可见明显的特异性条带，而对照组未见任何条带（见图5）。

图4 崂山奶山羊胎儿BMSCs成神经诱导结果（100×）

图5 神经诱导内参基因及特异性基因RT-PCR电泳结果

3 讨论

3.1 崂山奶山羊胎儿BMSCs的分离培养及干细胞因子的表达 间充质干细胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）是一类广泛存在于身体各个组织和器官中的成体干细胞［4-5］，因具有来源丰富和取材方便等优点，近年来成为一种重要的组织工程学研究的种子细胞［6-8］。目前的研究中，大部分是针对成体来源的BMSCs，而对于胎儿BMSCs的研究则相对较少。因此，该研究以崂山奶山羊胎儿的BMSCs为研究对象，旨在更深层次地了解MSCs的生物学意义及临床应用价值。

目前，国内外已有大量关于哺乳动物体外分离培养BMSCs的报道。随着组织工程种子细胞的大量应用以及体细胞克隆技术的发展，利用多种细胞进行体细胞克隆的研究已经成为供体细胞研究的方向。利用成体干细胞作为供体细胞进行动物克隆的研究也越来越多，而利用分离自胎儿的MSCs作为供体细胞的研究也逐渐成为该领域的研究热点。因此，该研究在结合体细胞克隆领域研究成果的基础上，以崂山奶山羊的BMSCs为研究对象，较为系统地研究了崂山奶山羊胎儿BMSCs的分离与培养方法。利用全骨髓贴壁法和差时换液法成功分离并得到了纯度较高的崂山奶山羊胎儿BMSCs，且在体外多次传代培养过程中证明了其具有良好的增殖和分化能力，这与Engler等［9］的描述相符。同时，崂山奶山羊胎儿BMSCs的倍增时间为29.7 h，证明了其具有良好的生长状态。

作为一种成体干细胞，BMSCs也能够表达Oct4、Sox2、Nanog等干细胞多能性因子［10］，因此，在该研究中这些因子被应用于干细胞的鉴定。该研究利用RT-PCR技术检测到了Oct4、Sox2、Nanog基因的正常表达，证明了分离自崂山奶山羊胎儿骨髓中的细胞是一种干细胞。

3.2 诱导成神经分化特性 众所周知，BMSCs是一种来源于中胚层的干细胞，但它的分化能力却并不限于中胚层［11］。在该研究中，笔者对其进行了跨胚层的诱导分化，成功地对其进行了向外胚层的诱导分化。在外胚层的神经细胞分化诱导中，BMSCs经预诱导24 h后，细胞形态没有发生明显的变化，但经正式诱导3 h后，细胞形态发生明显变化，形成类似神经元细胞的形态。染色后细胞内可见尼氏体，且细胞核呈紫蓝色染色。利用RT-PCR技术检测到了神经细胞特异性表达的ENO2和GFAP基因，该结果与Woodbury等［12］和Suzuki等［13］的研究结果基本相同，说明BMSCs能够向神经细胞分化，具有跨胚层分化的潜能。

4 结论

笔者对崂山奶山羊BMSCs的分离与培养方法进行了较为系统的研究，并对其生长特性和体外诱导分化能力进行了研究。分离得到的崂山奶山羊BMSCs经多次传代培养后呈均一的长梭形贴壁状态，证明了BMSCs具有跨胚层分化的潜能。

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Isolation,Culture and Induced Neuronal Differentiation of Laoshan Dairy Goat Fetal Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells

YANG Pei-pei1，CHENG Ming1，2，WANG Xue-mei1，LIU Meng-meng1，ZHANG Qian1，DAI Zheng-hao1，LIU Zong-zheng1，2
（1.Qingdao Municipal Institute for Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Qingdao 266100，China；2.Qingdao Aote Sheep Breeding Farm，Qingdao 266100，China）

The aims of the present study were to establish the optimal in vitro method for isolating,purifying and proliferating of Laoshan dairy goat fetal bone marrow-derived mesenchymal stem cells （BMSCs）and to assess their biological characteristic and induced neuronal differentiation potentiality.The femur samples were collected from a three-month-old fetus of a female Laoshan dairy goat.The BMSCs were harvested by centrifuging and were subsequently purified and proliferated.The population doubling time （PDT）of the BMSCs were determined.RT-PCR assay was used to assess the presence of oct4,Nanog and Sox2 genes. Passage 3 cultures of the BMSCs were used to conduct induced neuronal differentiation experiment,and the induced products were histologically and genetically identified.The results showed that the morphology of the isolated cells were uniform and was fibroblasts-liking spindle and the presence of oct4,Nanog and Sox2 genes were detected.After sub-cultured,the growth cells entered exponential growth phase on the 4thday and subsequently entered platform growth phase on the 8thday.The PDT of the first 10 passage cultures was 29.7 h.After induced neuronal differentiation,the purple-blue Nissl body was observed by toluidine blue staining method in passage 3 cultures.The specific expression of ENO2 and GFAP genes were positive in the induced cells. The results demonstrated that the BMSCs of Laoshan dairy goat is potential to be differentiated to neurons.

Laoshan dairy goat；fetus；BMSCs；induced differentiation

R329.28；S827.3

A文章顺序编号：1672-5190（2016）09-0099-05

2016－07－30

项目来源：山东省现代农业产业技术体系羊产业创新团队青岛综合试验站（SDAIT-09-011-12）；青岛市民生科技计划项目（14-2-3-45-nsh）。

杨培培（1986—），女，兽医师，硕士，主要研究方向为畜牧生产。

刘宗正（1985—），男，畜牧师，博士，主要研究方向为动物发育生物学。

（责任编辑：赵俊利）