不同剂量环磷酰胺对小鼠免疫功能抑制作用的研究

李 璐，黄宏业，韦现色，王秋华，杨善忠，何家康，杨 剑，胡庭俊

（1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2.广西北斗星动物保健品有限公司，广西 南宁 530003）

不同剂量环磷酰胺对小鼠免疫功能抑制作用的研究

李 璐1，黄宏业2，韦现色1，王秋华1，杨善忠2，何家康1，杨 剑1，胡庭俊1

（1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2.广西北斗星动物保健品有限公司，广西 南宁 530003）

旨在观察不同剂量及不同给药方式下环磷酰胺对健康小鼠的免疫抑制作用，探索建立小鼠环磷酰胺免疫抑制模型的方法。采用腹腔注射法给予小鼠不同剂量的环磷酰胺，通过测定免疫器官指数，血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐含量，血液白细胞数量，脾淋巴细胞转化率等指标，评价环磷酰胺对小鼠机体免疫力以及肝肾功能的影响。结果表明，连续7 d分别给予小鼠腹腔注射10、20、30、40 mg/（kg·BW）的环磷酰胺和单次注射150 mg/（kg·BW）的环磷酰胺，均可对小鼠产生不同程度的免疫抑制作用，并引起肝肾功能相关指标的变化；低剂量多次注射环磷酰胺产生的免疫抑制效果优于高剂量单次注射，且在低剂量多次注射时，免疫抑制效果随注射剂量的升高而增强。连续7 d给予健康小鼠腹腔注射30～40 mg/（kg·BW）的环磷酰胺，可建立小鼠免疫抑制模型。

小鼠；环磷酰胺；给药剂量；给药方式；免疫抑制

在畜禽养殖业中，免疫增强剂主要用于提高动物机体免疫功能。动物免疫抑制模型的建立是评价免疫增强剂对实验动物免疫功能提高效果的重要环节。已有研究表明，利用物理、化学和辐射等造模手段导致小鼠暂时性处于免疫低下状态，比遗传性小鼠免疫低下更易于获得，因而被广泛应用［1-3］。目前，常用的化学造模药物有环磷酰胺、氢化可的松、地塞米松、环孢菌素A、放线菌素等［4］。环磷酰胺是治疗恶性肿瘤的代表药物，具有广谱的抗癌作用，但其同样具有免疫抑制作用，因此，环磷酰胺被广泛用作免疫抑制剂来制备免疫抑制模型。该研究旨在探讨环磷酰胺以不同的给药剂量和给药方式对小鼠产生的免疫抑制作用，为研究多糖等免疫活性物质的免疫调节作用过程中免疫低下动物模型的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康昆明种小鼠60只，SPF级，雌雄各半，体重18～22 g，购自广西医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂 环磷酰胺（注射用粉针，上海华联制药有限公司产品），RPMI-1640培养基（Gibco），胎牛血清（Hyclone），台盼蓝、MTT、SDS、ConA、Tris均为Sigma公司产品，L-谷氨酰胺，青霉素，链霉素及其他国产分析纯试剂。谷丙转氨酶（赖氏法）试剂盒、谷草转氨酶（赖氏法）试剂盒、尿素氮（二乙酰—肟法）试剂盒、肌酐（苦味酸法）试剂盒均购于南京建成生物工程有限公司。

1.3 动物分组及处理 将小鼠随机分为6组，每组10只。第1组为空白对照组，腹腔注射生理盐水；第2～5组分别按10、20、30、40 mg/（kg·BW）的剂量腹腔注射环磷酰胺注射液，每天1次，连续给药7 d；第6组为环磷酰胺高剂量单次给药对照组，试验第1天按150 mg/（kg·BW）的剂量腹腔注射环磷酰胺1次，之后6 d注射相同体积的生理盐水。各组小鼠正常饲养7 d。

1.4 免疫器官指数及肝肾功能主要指标的测定于试验第8天时对小鼠进行眼眶采血，分离血清，保存备用。颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏、胸腺，称重，计算免疫器官指数。检测血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐的含量。

1.5 白细胞计数 取小鼠血液0.02 mL，加入3%乙酸溶液0.38 mL稀释血液，用小滴管从摇匀的稀释液中吸取少量液体加入血细胞计数池内，静置1～2 min，在显微镜下用低倍镜计数4个大方格的白细胞总数，然后将该数值乘以50，即得每立方毫米的白细胞数。

1.6 脾淋巴细胞转化率的测定 颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏，置于含5 mL PBS液的灭菌平皿中，在200目不锈钢网上研磨并过筛，制成单细胞悬液。收集细胞悬液，1 500 r/min离心8 min，弃上清液。加入10倍体积Tris-NH4Cl，混匀，室温放置5～10 min，1 500 r/min离心10 min，弃上清，用PBS洗2次后用10%FCS-RPIM-1640洗1次，再用10% FCS-RPIM-1640重悬细胞。细胞计数，调整细胞浓度至1×106个/mL。将上述细胞悬液加入96孔平底培养板中，每孔0.1 mL。将培养板置于含有5%CO2的37℃培养箱中培养68h，每孔吸弃上清液110μL，然后向培养板各孔内加入 1 mg/mL的 MTT液10 μL，37℃培养4 h。各孔加入DMSO 100 μL，摇匀后，10 min内用酶标测定仪测OD550nm值。

1.7 数据处理与分析 利用SPSS 21.0软件，采用方差分析法对试验数据进行统计分析，P＜0.05时认为差异显著，P＜0.01时认为差异极显著。试验结果以±SD表示。

2 结果与分析

2.1 不同剂量环磷酰胺对小鼠免疫器官指数的影响 由表1可知，腹腔注射环磷酰胺后，第2～6组小鼠的胸腺指数均极显著低于第1组（P＜0.01），第2～5组小鼠的脾脏指数均极显著低于第1组 （P＜0.01）；第2～5组小鼠的脾脏指数均极显著低于第6组（P＜0.01）。结果提示，低剂量多次注射以及高剂量单次注射环磷酰胺均可对小鼠的免疫器官发育产生抑制作用，且低剂量多次注射的抑制效果优于高剂量单次注射。同时，在低剂量多次注射时，环磷酰胺剂量越高，对小鼠免疫器官发育的抑制作用越强。

表1 不同剂量环磷酰胺对小鼠免疫器官指数的影响mg/g

表2 不同剂量环磷酰胺对小鼠肝肾功能的影响

2.2 不同剂量环磷酰胺对小鼠肝肾功能的影响由表2可知，第2～6组小鼠的血清谷草转氨酶含量与第1组相比均有一定程度的升高，其中第4组小鼠的血清谷草转氨酶含量极显著高于第1组 （P＜0.01），第6组小鼠的血清谷草转氨酶含量显著高于第1组（P＜0.05）；第2～6组小鼠的血清谷丙转氨酶含量均极显著高于第1组（P＜0.01）；第2～6组小鼠的血清尿素氮含量与第1组相比均有所升高，其中第2组和第5组小鼠的血清尿素氮含量极显著高于第1组（P＜0.01）；第2～5组小鼠的血清肌酐含量与第1组相比差异均不显著（P＞0.05），但第6组小鼠的血清肌酐含量显著低于第1组（P＜0.05）。结果提示，低剂量多次注射以及高剂量单次注射环磷酰胺对小鼠的肝脏和肾脏功能均有一定程度的影响。

2.3 不同剂量环磷酰胺对小鼠白细胞数量的影响由表3可知，注射环磷酰胺后，第2～6组小鼠的白细胞数量均有所下降，其中，第2组、第5组和第6组小鼠的血液白细胞数量与第1组相比差异极显著（P＜0.01），第3组和第4组小鼠的血液白细胞数量与第1组相比差异显著（P＜0.05）。结果提示，低剂量多次注射以及高剂量单次注射环磷酰胺均可减少小鼠血液中的白细胞数量。

表3 不同剂量环磷酰胺对小鼠白细胞数量的影响

2.4 不同剂量环磷酰胺对小鼠脾淋巴细胞转化率的影响 由表4可知，第2～5组小鼠的脾淋巴细胞转化率与第1组相比均有一定程度的降低，其中，第4组小鼠的脾淋巴细胞转化率极显著低于第1组（P＜0.01），第2组和第5组小鼠的脾淋巴细胞转化率显著低于第1组（P＜0.05）；第6组小鼠的脾淋巴细胞转化率极显著高于第1组（P＜0.01）；第2～5组小鼠的脾淋巴细胞转化率均极显著低于第6组（P＜0.01）。结果提示，低剂量多次注射环磷酰胺可在一定程度上降低小鼠的脾淋巴细胞转化率。

表4 不同剂量环磷酰胺对小鼠脾淋巴细胞转化率的影响

3 讨论

环磷酰胺是治疗恶性肿瘤最常用的烷化剂代表药物，是联合化疗、手术和放疗辅助化疗的常用药物之一，具有广谱的抗癌作用。此外，环磷酰胺还具有较强的免疫抑制作用。由于类似于多糖的免疫调节物质应用的对象主要是机体免疫功能下降的个体，所以其功效的评价过程中应选用免疫功能低下的动物模型进行试验。然而多糖类免疫调节物质的起效周期较长，因此，需要选择一种效果明显、维持时间长的免疫抑制模型，从而为免疫调节物质功能的评价提供更好的参考依据。现有的模型多采用一次性注射高剂量药物造模［5］，但研究表明其造成的免疫抑制维持时间不超过2周，此外，高剂量给药有可能造成免疫抑制作用强度过大，超出了免疫调节物质的调节范围［6］。因此，该研究采用较低剂量的环磷酰胺，采用连续多次给药的方式，评价不同给药剂量对小鼠免疫功能的影响，进而建立一种稳定的免疫抑制模型。

免疫器官指数表现免疫器官的发育状况，间接地反映了机体的免疫状态。环磷酰胺属于免疫抑制性药物，对小鼠的免疫器官，如胸腺、脾脏的发育均具有抑制作用。该研究结果表明，腹腔注射不同剂量的环磷酰胺后，小鼠的胸腺指数和脾脏指数与空白对照组相比极显著降低，且多次注射不同剂量的环磷酰胺，小鼠的胸腺指数和脾脏指数随着注射剂量的增加而降低，表明多次给药时，高剂量环磷酰胺的免疫抑制作用强于低剂量。而单次注射高剂量的环磷酰胺，小鼠的胸腺指数和脾脏指数高于低剂量多次注射，这有可能是免疫抑制维持的时间不够长致使小鼠免疫力恢复。

注射环磷酰胺后，各组小鼠的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮含量均呈现一定程度的升高，由此可知，环磷酰胺可以造成一定程度上的肝肾功能损伤。此外，环磷酰胺也可造成小鼠血液白细胞数量减少。

淋巴细胞只有向成熟T淋巴细胞转化才能发挥免疫效应，因此，脾淋巴细胞转化率是评价细胞免疫功能的一个重要指标，其活化过程可能是：T细胞与抗原或有丝分裂原结合，导致DNA合成启动［7］。该研究结果表明，低剂量多次注射环磷酰胺能降低小鼠的脾淋巴细胞转化率，而高剂量单次注射后，其转化率反而增高，这可能是由于免疫抑制后脾淋巴细胞出现代偿生长，具体机制还需进一步研究证实。

4 结论

低剂量多次注射环磷酰胺对小鼠产生的免疫抑制效果优于高剂量单次注射，且在低剂量多次注射时，免疫抑制效果随注射剂量的升高而增强。连续7d给予健康小鼠腹腔注射30～40mg/（kg·BW）的环磷酰胺，可建立小鼠免疫抑制模型。

［1］樊永平，聂惠民，周勇，等.健脾金丹对正常小鼠及环磷酰胺所致免疫受抑小鼠免疫功能的增强作用［J］.中国中西医结合杂志，1993，13（4）：223-225.

［2］丁传林，吴旭东，金安娜，等.β-胡萝卜素立体异构体对环磷酰胺处理小鼠免疫功能的比较研究［J］.中国生化药物杂志，1997，18（1）：19-21.

［3］MAYUMI H，UMESUE M，NOMOTO K，et al. Cyclophosphamide-induced immunological tolerance：an overview［J］.Immunobiology，1996，195（2）：129-139.

［4］李业鹏，计融，韩春卉，等.建立小鼠免疫低下模型的初步研究［J］.中国食品卫生杂志，2001，13（6）：7-10.

［5］中华人民共和国卫生部药政局.新药（西药）临床前研究原则汇编（药学，药理学，毒理学）［G］.北京：中华人民共和国卫生部，1993：128-137.

［6］MILTON JD，CARPENTER CB，ADDISON IE. Depressed T-cell reactivity and suppressor activity of lymphoid cells from cyclophosphamide-treated mice［J］. Cell Immunol，1976，24（2）：308-317.

［7］罗洪清，孟庆勇.不同剂量环磷酰胺对正常小鼠淋巴细胞增殖反应的影响［J］.癌变·畸变·突变，2003，15（2）：79-81.

Immunosuppression Effect of Different Doses of Cyclophosphamide on Mice

LI Lu1，HUANG Hong-ye2，WEI Xian-se1，WANG Qiu-hua1，YANG Shan-zhong2，HE Jia-kang1，YANG Jian1，HU Ting-jun1
（1.College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China；2.Guangxi Beidouxing Animal Health Products Co.，Ltd.，Nanning 530003，China）

The aims of the present study were to observe the immunosuppression effect of cyclophosphamide with different dosage regimen on mice and to explore the method for establishing immunosuppression model induced by cyclophosphamide in mice. Single or multiple doses of cyclophosphamide were intraperitoneally injected in mice.The immune organ index,serous level of alanine aminotransferase,aspartate aminotransferase,urea nitrogen and creatinine,blood leukocyte count,and splenic lymphocyte transformation were determined to evaluate the effect of cyclophosphamide on immunity and hepatic and renal function of mice. The results showed that both the multiple administration of 10,20,30,40 mg/（kg·BW）of cyclophosphamide for consecutive seven days respectively and single administration of 150 mg/（kg·BW）of cyclophosphamide exhibited immunosuppression effect on mice and caused the changes of indicators associated with hepatic and renal function;the immunosuppression effect produced by multiple administration with lower dosage of cyclophosphamide was superior to that produced by single administration with higher dosage,and the immunosuppression effect was improved with the increase of dosage under multiple administration mode. The combined data suggest that the immunosuppression model in mice can be established by multiple administration of 30-40 mg/（kg·BW）of cyclophosphamide for consecutive seven days.

mice；cyclophosphamide；administration dosage；dosage regimen；immunosuppression

S859.7

A文章顺序编号：1672-5190（2016）09-0001-03

2016－08－05

项目来源：国家自然科学基金资助项目（31560708）；高等学校博士学科点专项科研基金博导类资助课题（20134501110004）；南宁市科学研究与技术开发计划项目（合同编号：20155181）。

李璐（1988—），女，硕士研究生，主要研究方向为中药免疫药理学。

胡庭俊（1965—），男，教授，博士，博士生导师，主要从事中兽药的开发与研究工作。

（责任编辑：赵俊利）