葡萄miR164家族生物信息学分析及靶基因预测

王丽丽，葛金涛，刘兴满，赵统利

(连云港市农业科学院，江苏 连云港 222000)



葡萄miR164家族生物信息学分析及靶基因预测

王丽丽，葛金涛，刘兴满，赵统利*

(连云港市农业科学院，江苏 连云港 222000)

MicroRNAs(miRNAs)对植物抗逆及生长发育过程起着重要的调控作用，而miR164是植物特有的miRNA，它对应的靶基因主要是NAC转录因子家族。采用生物信息学方法对葡萄以及其他几个物种的miR164家族成员前体进行进化分析、前体二级结构预测、成熟序列碱基保守性分析以及在葡萄NAC转录因子家族71个成员中进行靶基因预测分析。结果表明：葡萄miR164家族成员的前体序列与双子叶植物聚在一个分支，符合进化规律；葡萄miR164家族4个成员前体序列均可形成稳定的二级茎环结构，成熟序列的碱基保守性较高；葡萄miR164家族成员对应的NAC家族靶基因有2个(GSVIVT01007982001与GSVIVT01020478001)，经在NCBI进行BLAST分析，发现均与植物的根发育相关。这暗示着葡萄miR164家族与其靶基因在植物的抗逆过程中发挥重要的调控作用。

葡萄；miR164；靶基因；抗逆；生物信息学

微小RNA(MicroRNAs)是一类非编码小分子RNA，在植物中主要通过介导靶基因降解对调控生长发育及抗逆过程发挥作用[1]。近年来的研究表明，miRNAs在植物响应逆境胁迫过程中起着重要的作用[2]，如在毛竹(Phyllostachys edulis)中，miR397和miR1432的表达量均受不同胁迫条件的影响，如高温(42℃)、低温(4℃)、高盐和干旱[3]；在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过表达水稻(Oryza sativa)miR393会提高转基因植株的耐盐性[4]；同时在不同物种中，同样的miRNA可能发挥不同的作用，如在拟南芥中过表达miR169时可降低植株的抗旱性，而相反，在番茄(Solanum lycopersicum)中过表达miR169会提高植株的抗旱性[5]。

葡萄(Vitis vinifera)是全球性果树之一，具有较高的经济效益，但目前其产量却受到逆境胁迫的影响，因此提高葡萄抗逆性的研究越来越受到关注。目前对葡萄抗逆相关方面的研究仅仅集中在生理指标检测及抗逆相关基因研究的层面上，而从非编码基因miRNA方面对葡萄进行的抗逆方面研究还未见报道。

miR164家族是植物特有的miRNA家族，在葡萄中存在4个家族成员，分别为vvi-miR164a，vvi-miR164b，vvi-miR164c以及vvi-miR164d；miR164主要靶基因是植物NAC转录因子，而植物NAC转录因子家族也同样是植物特有的，其在N端约有150个氨基酸组成高度保守的结构域(分为5个亚结构域A，B，C，D，E)[6]。NAC转录因子参与生物学过程较广泛，包括细胞分裂、器官边界、细胞次生壁合成等植物生长发育过程，同时也参与调控植物对盐、干旱等非生物逆境胁迫的响应过程[7]。以葡萄为研究对象，通过对葡萄miR164家族成员前体序列、成熟序列及靶基因序列进行生物信息学分析，以期从非编码基因方面为今后葡萄抗逆性研究提供新的参考。

1　材料与方法

1.1材料

利用数据库miRbase 21.0(http://www.mirbase.org/index.shtml)[8]下载葡萄、番茄(Salynum lycopersicum)、苹果(Malus domestic)、碧桃(Prunus persica)、烟草(Nicotiana tabacum)、水稻、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的miR164家族成员前体序列和成熟序列；通过北京大学植物转录因子数据库(PlantTFDB∶http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php)[9]下载葡萄NAC转录因子家族成员序列(71条)；利用美国生物信息技术中心(NCBI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对目标基因进行BLAST初步分析。

1.2方法

利用在线工具RNAfold WebServer(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)预测miRNA的前体二级茎环结构；利用MEGA 6.0软件构建基于葡萄、苹果、碧桃、水稻、二穗短柄草等miR164家族成员前体序列系统进化树；利用在线平台WebLOGO(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)[10]分析各物种的miRNA成熟序列的碱基保守性；通过在线平台http://plantgrn.noble.org/psRNATarget[11]预测葡萄miR164的靶基因及其作用位点。

2　结果与分析

2.1系统发生树

建立基于葡萄、苹果等物种miR164家族成员前体序列进化树，结果表明，总体分为两大分支(图1)，葡萄miR164家族4个成员(圆形标记)均与双子叶植物聚类在一起，如苹果、碧桃、烟草和番茄，而单子叶植物单独聚类在一起，如二穗短柄草和水稻，均符合植物的进化规律。但是同时也发现，葡萄vvi-MIR164a和vvi-MIR164d与苹果mdm-MIR164c和碧桃ppe-MIR164b聚类在一个分支，而葡萄vvi-MIR164b与苹果mdm-MIR164a和碧桃ppe-MIR164d聚类在一个分支，葡萄vvi-MIR164c则相对与葡萄其他3个miR164家族成员进化关系较远。这种情况同时也出现于其他物种中，即来自同一物种家族不同成员被聚类于不同的分支，表明植物miRNA的前体序列具有比较丰富的多样性。这与毛竹中miR397和miR1432前体序列进化分析结果相类似[3]。

2.2前体二级结构预测分析

图1　基于前体序列构建的系统进化树Fig.1　Phylogenetic tree based on the sequence of precursors

经前体二级结构预测分析，葡萄miR164家族4个成员前体序列均可形成稳定的二级茎环结构，且葡萄miR164家族4个成员成熟序列均产生于各自对应前体序列的5′端臂上(图2)。

2.3成熟序列碱基保守性分析

在miR164的92个家族成员中，59个成员有着完全相同的成熟序列(5’-UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA-3’，被认为是miR164家族标准成熟序列)，其他的成员和标准成熟序列相比，分别都有1～5个碱基的差异[12]。葡萄miR164家族有4个成员，经在线碱基保守型分析表明，葡萄与其他几个物种的miR164家族成员成熟序列基本与标准序列碱基种类是一致的(图3)，其中vvi-miR164a，vvi-miR164c和vvi-miR164d与家族标准序列碱基种类完全一致，只有vvi-miR164b仅在3′端最后一位碱基存在差异，即由A成为U。说明葡萄miR164家族成员成熟序列碱基保守性较高。

2.4靶基因预测分析

经靶基因在线预测，结果表明：葡萄miR164家族，4个成员在葡萄NAC基因库中均有对应的靶基因存在，且对应的靶基因主要有2个，分别为GSVIVT01007982001和GSVIVT01020478001，与葡萄miR164家族成员成熟序列碱基几乎完全匹配(图4)；通过在NCBI中进行BLAST分析，结果发现GSVIVT01007982001预测蛋白与蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)中NAC转录因子蛋白相似性较高，研究表明其主要参与植物根瘤菌共生过程[13]；GSVIVT01020478001预测蛋白则与毛果杨(Populus trichocarpa)中NAC1蛋白相似性较高，而植物NAC1基因主要参与植物的侧根生长发育过程，进而影响植物的抗逆性[14]。因此，可推断出葡萄miR164家族成员与其靶基因家族成员可能主要在植物根发育过程中发挥重要的调控作用。

3　结论与讨论

自从Carrington等[15]2002年首次在拟南芥中克隆到miRNA后，越来越多的研究发现，miRNA不仅参与植物的生长发育过程，在植物应对逆境胁迫，如干旱[15]，冻害[16]，高盐[17]等的响应过程中，也发挥着重要的调控作用。miR164家族是植物特有的miRNA家族，其与对应靶基因之间的互作在植物器官形态建成以及响应逆境胁迫过程中起着关键的作用。

图2　前体二级结构预测Fig.2　Secondary structure prediction of precursors

图3　葡萄miR164家族成员成熟序列碱基保守性分析Fig.3　Conserved nucleotide sequence analysis of miR164 in Vitis vinifera

图4　葡萄miR164家族成员与靶基因匹配序列Fig.4　Sequences matched with miR164 members in Vitis vinifera

本文主要利用生物信息学方法对葡萄miR164家族成员前体序列进行进化分析，并对其二级结构进行预测，同时对各个成员成熟序列的碱基保守性进行分析，并在相关数据库71个NAC家族成员进行了靶基因预测，结果表明，葡萄miR164家族4个成员前体序列均可形成稳定的颈环结构，且其成熟序列基本均与miR164家族标准序列相一致，这与Sunkar等[18]在水稻中的研究结果相一致，即植物miR164家族成熟序列保守性很高；通过靶基因预测，结果表明葡萄miR164家族成员主要对应的靶基因有2个，分别为GSVIVT01007982001与GSVIVT01020478001，经蛋白序列预测功能后，发现二者均与植物根发育相关，同时也影响植物的抗旱性，这个预测结果与Li等[19]和Fang等[12]分别在玉米(Zea mays L.)和水稻中的研究结果相一致。

但是miRNA及其靶基因之间的调控是一个极为复杂的网络，二者之间可能存在一对多或者多对一的调控作用关系，既体现出其参与生物学过程的广泛性，同时又体现出二者相互作用的精确性。在拟南芥中过表达miR164a和miR164b时导致植株子叶和花器官出现融合等现象[20]。ORE1/NAC2基因有促进植物叶片衰老功能，其表达受到miR164的调控，同时miR164本身的表达又受EIN2基因表达的抑制，因此它们之间的相互作用关系形成了参与调控植物叶片衰老过程的重要调节网络[21]。另外miR164可降低NAC1的表达量，导致植物侧根数目减少，同时二者的表达又受到生长素的诱导，说明miR164和其靶基因也可能参与到植物激素信号途径调控中[22]。目前，对葡萄miR164家族更深入的研究尚未见报道，如除NAC转录因子家族外，葡萄miR164家族成员是否还有其他家族的靶基因成员；葡萄miR164家族成员对其靶基因的切割作用位点是否具有保守性，即是否和其他物种miR164家族成员一样，作用位点位于miR164成熟序列的10～11位碱基之间(5′→3′)；葡萄miR164家族成员组织特异性表达与其他物种相比是否存在差异等，这些问题仍有待进一步研究。本文首次初步对葡萄miR164家族成员进行了序列生物信息学分析以及对其靶基因进行预测，除上述问题需进一步研究外，仍需利用转基因技术对miR164及其靶基因的功能与关系进行深入探讨，以期为今后葡萄抗逆新品种选育提供新的途径。

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(责任编辑张韵)

Bioinformatics analysis of the MiR164 family and prediction of target gene in Vitis vinifera

WANG Li-li，GE Jin-tao，LIU Xing-man，ZHAO Tong-li*

(Lianyungang Academy of Agricultural Sciences，Lianyungang 222000，China)

MicroRNAs (miRNAs) play a very important role in regulating the stress resistance and growth development.MiR164 is specific in plants，whose target gene is mainly NAC transcription factor family.By utilizing the bioinformatic methods，we analyzed the phylogenetic of miR164 in Vitis vinifera and some other plants，predicted and analyzed the secondary structure of miR164 family members，the base conservation of the mature sequence，as well as the target gene in NAC (71 members) family of Vitis vinifera.The results showed that four members of miR164 in Vitis vinifera were clustered with the dicotyledon plants，which was accorded with evolution law.The precursors of four members could form stable secondary stem-loop structure.Otherwise，the base of mature sequence of four members were highly conserved.According to predicting and analyzing of the target gene，we found two NAC members (GSVIVT01007982001 and GSVIVT01020478001).By BLAST in NCBI，it showed that they were related with plant root development，which indicated that miR164 family and their target gene in Vitis vinifera play important regulatory role in root development and stress resistance.

Vitis vinifera;miR164;target gene;stress resistance;bioinformatics

浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):441-446http://www.zjnyxb.cn

王丽丽，葛金涛，刘兴满，等.葡萄miR164家族生物信息学分析及靶基因预测[J].浙江农业学报，2016，28(3)： 441-446.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.13

2015-08-17

苏北科技发展计划项目(BN2014101)

王丽丽(1988—)女，山西长治人，硕士，从事果树及观赏树木育种研究。E-mail：wangllawj@163.com

，赵统利，E-mail：yyyy28@126.com

Q943.2

A

1004-1524(2016)03-0441-06