复方柴芩颗粒对鸭黄曲霉毒素慢性中毒CYP450酶活性的影响

李 杨，高 祝，荣 茜，杨晓敏，张 睿，李英伦

(四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130)



复方柴芩颗粒对鸭黄曲霉毒素慢性中毒CYP450酶活性的影响

李 杨，高 祝，荣 茜，杨晓敏，张 睿，李英伦

(四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130)

建立肉鸭aflatoxin B1(AFB1)慢性中毒模型，设立正常组、模型组、亚硒酸钠组、复方柴芩颗粒(中药)高、中、低剂量组。造模后第7，14和21天处死肉鸭取肝，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测肝标本中CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性。结果表明，与模型组相比，中药高、中、低剂量组用药7和14 d后肝脏微粒体细胞色素P450酶系CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性显著降低；用药21 d后CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性升高，但与模型组相比差异不明显。说明前期复方柴芩颗粒通过抑制CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性，减少AFB1前体物质代谢激活，降低其化学性肝脏损伤达到保护肝脏的作用。而用药后21 d CYP450活性升高的原因可能是AFB1蓄积较多，需要更多的CYP450代谢AFB1。

细胞色素CYP1A2；细胞色素CYP3A4；细胞色素CYP2E1；复方柴芩颗粒；黄曲霉毒素B1

黄曲霉毒素B1(AFB1)是已知霉菌毒素中毒性最强的一种。长期采食含有此类毒素的饲料可对动物产生化学性肝损伤，严重的甚至产生肝癌等病变[1-2]。1993年世界卫生组织癌症机构就将黄曲霉素列为Ⅰ类致癌物[3]。肝微粒体(liver microsomes)细胞色素P450酶系(cytochrome P450，CYP450)为一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族[4]，依次可分为家族、亚家族和亚型[5]。其参与内源性、外源性和其他合成化合物的代谢和生物转化，在解毒和生物活化等方面起了重要作用[6]。肝脏是黄曲霉素(aflatoxin)在动物体内的重要靶器官，黄曲霉素必须经过体内生物转化才能表现出剧毒性，主要与CYP450的氧化作用有关[7-8]。研究报道与AFB1代谢活化有关的CYP450超家族成员主要有CYP3A4，CYP2E1，CYP1A2等[9]。大量文献报道了有关大鼠的AFB1慢性中毒过程中CYP450超家族的影响，而对肉鸭的研究报道几乎处于空白状态。所以本实验利用肉鸭肝微粒体混合酶体外代谢体系，用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测肉鸭AFB1慢性中毒过程中CYP1A2，CYP3A4，CYP2E1活性变化，并借此探讨“复方柴芩颗粒”在治疗肉鸭AFB1慢性中毒的药理作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 动物1日龄健康樱桃谷肉鸭126羽(四川省雅安市洪池天府肉鸭养殖示范基地提供)。

1.1.2 试剂和药品黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品(MSS1003，Pribolab北京泰勒棋科技公司代理)；分析纯亚硒酸钠；“复方柴芩颗粒” (四川农业大学中兽医实验室，由柴胡、黄芩、黄芪、五味子和泽泻为原料制成)；鸭细胞色素P450亚酶CYP3A4，CYP1A2及CYP2E1活性检测试剂盒(ELISA法)(上海哈灵生物科技有限公司)；甘必应-鸭病毒性肝炎弱毒活疫苗(CH60株)(哈药集团)；禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗(H5N1 Re-5+H9N2 Re-2株)(哈尔滨维科生物技术开发公司)。

1.1.3 仪器和材料Centrifuge 5804R高速冷冻离心机(Eppendorf公司)；Sorvall Stratos型冷冻高速离心机(Thermo Scientific公司)；imark型酶标仪(Bio-rad公司)；FSH-2A型组织匀浆机(无锡沃信仪器有限公司)；FuheHH-6型恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限公司)；GNP-9270型隔水式CO2培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；pHs-25型酸度计(成都方舟科技开发公司)；各种型号移液枪(Thermo Scientific)；一次性注射器；各种型号离心管；手术剪等。

1.2 方法

1.2.1 分组及饲养管理

(1)将126羽1日龄健康樱桃谷肉鸭随机分成6组。分别为正常健康组(A组)、AFB1组(B组)、亚硒酸钠组(C组)、高剂量药物组(D组)、中剂量药物组(E组)和低剂量药物组(F组)。用未添加亚硒酸钠的基础配合日粮饲喂6 d。第7天开始使用不同饲喂计划。

(2)第7天开始，正常健康组再继续饲喂基础配合日粮，并给予每日每只肉鸭5 mL生理盐水灌服。AFB1组饲喂含有AFB1 40 μg·kg-1的基础配合日粮，同样给予每日每只肉鸭灌服5 mL生理盐水。三种剂量药物组在饲喂含有AFB1 40 μg·kg-1的基础配合日粮的同时，分别按高中低剂量灌服含“复方柴芩颗粒” 2.0 g·mL-1，1.0 g·mL-1，0.5 g·mL-1(按原生药计)的药液5 mL。亚硒酸钠组饲喂含AFB1 40 μg·kg-1的基础配合日粮并每日每只按肉鸭体重1 mg·kg-1溶于5 mL水后灌服[10]。实验开始前1周，动物房需彻底打扫，使用的所有器具要清洗干净并熏蒸消毒1 d，之后开门窗散味5 d后动物入住。在实验过程中，给实验动物提供适宜温度、24 h光照和干净充足的水源，2日龄时接种鸭病毒性肝炎弱毒活疫苗，14日龄时接种禽流感灭活疫苗。

1.2.2 样品采集处理造模后第7，14，21天三个时间点分别在每组取7羽肉鸭，放血致死。快速取出肝脏，即用冰冷的生理盐水反复冲洗。放在冰盒中备用。

1.2.3 肉鸭肝微粒体制备在已取出的每个肝脏中准确称取2 g组织，将组织剪碎，按照1 g组织加4 mL TMS缓冲液(pH=7.5)标准，加入8 mL TMS缓冲液，入组织匀浆机中，制成20%(m/V)匀浆。然后置低温高速离心机12 000g，4 ℃离心15 min，舍弃沉淀部分，移上清部分于2 mL EP管中，每管装1.2 mL上清液，保留4管。每管上清液中加入88 mmol·L-1CaCl2，使终浓度为8 mmol·L-1，混匀后放置5 min后25 000g，4 ℃离心15 min取沉淀；用200 μL Tris-HCl(PH=7.4)将沉淀重悬， 并加入200 μL 20%甘油于-80 ℃冻存，用于检测CYP3A4，CYP1A2，CYP2E1活性[11]。

1.2.4 CYPs活性检测按照鸭细胞色素P450亚酶CYP3A4，CYP1A2及CYP2E1活性检测试剂盒说明书操作。

1.3 统计学分析

2 结果与分析

2.1 各组CYP3A4活性

与模型组相比，造模后第7和14天，正常组、高、中、低剂量组CYP3A4活性显著降低；第21天时，正常组活性显著低于模型组，高、中剂量组活性与模型组无显著差异，低剂量组的CYP3A4活性显著高于除阳性对照组外的所有组。复方中药3种剂量组的CYP3A4活性随时间延长而升高，造模后第21天的上升幅度最大。在数值上看，中剂量组更接近于正常值，尤其是造模后第21天。亚硒酸钠组在3个时间点的CYP3A4活性均显著高于其余5组。差别具有统计学意义(P<0.05)。具体见表1。

2.2 各组CYP1A2活性

与模型组相比，造模后第7天和第14天，正常组和“复方柴芩颗粒”高中低剂量3组的活性显著降低；造模后第21天，中药高中低剂量3组活性高于模型组但差异并不显著。在相同造模时间的组间对比下，从数值上看均为中药高剂量组最小，相对更接近正常值，但是3种剂量组的对比未呈现显著差异。从造模后的3个时间点看，亚硒酸钠组的活性均显著高于其余5组。整个实验处于动态学观察各组的CYP1A2活性，复方中药3种剂量组的CYP1A2活性随时间延长而升高，造模后第21天的上升幅度最大。差别有统计学意义(P<0.05)。具体见表2。

表1 复方柴芩颗粒对CYP3A4活性的影响 (单位：U·L-1)

Table 1 Effect of compound chai qin particles on CYP3A4 activity (Unit: U·L-1)

投药时间/dA组B组C组D组E组F组737.64±1.20c60.02±0.83b70.71±1.21a41.69±0.65Bc43.12±0.43c43.22±0.61c1437.82±1.34c61.54±0.99b73.29±1.40a43.80±1.03Bc45.51±0.80c45.51±0.84c2138.08±0.73c61.08±1.09b73.26±0.62a55.01±1.40Bb61.68±0.62b71.38±1.00a

注：同行数据后无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。下同。

表2 复方柴芩颗粒对CYP1A2活性的影响(单位：U·L-1)

Table 2 Effect of compound chai qin particles on CYP1A2 activity (Unit: U·L-1)

投药时间/dA组B组C组D组E组F组737.43±1.07c60.77±1.31b72.43±0.76a42.17±0.94c43.25±0.47c43.73±0.51c1439.59±0.93c61.23±1.13b73.21±0.89a43.37±0.61c44.96±0.31c45.45±0.68c2137.00±0.62c59.81±0.64b77.92±0.68a59.91±0.83b61.85±0.60b65.88±1.07b

2.3 各组CYP2E1活性

与模型组相比，造模后第7天和第14天，正常组、高、中、低剂量组CYP2E1的活性显著降低，其中高剂量组活性下降趋势更明显；造模后第21天，中药高中低剂量3组活性却在数值上高于模型组，但差异并不显著。正常组依旧显著低于模型组。在3个测定时间点数值上看均为中药高剂量组最小，相对更接近正常值。整个实验处于动态学观察各组的CYP2E1活性，发现高中低剂量3组的活性随着用药时间延长而升高，第21天活性升高趋势最明显。从造模后第7，14，21天这3个时间点亚硒酸钠组的CYP2E1活性一直显著高于其余5组。差别有统计学意义(P<0.05)。具体见表3。

表3 复方柴芩颗粒对CYP2E1活性的影响(单位：U·L-1)

Table 3 Effect of compound chai qin particles on CYP2E1 activity (Unit: U·L-1)

投药时间/dA组B组C组D组E组F组737.39±1.07c58.59±0.61b72.69±2.07a41.49±0.76c42.40±0.80c44.02±1.09c1438.52±1.07c60.01±1.35b72.00±1.38a43.73±0.32c44.18±0.55c45.00±1.87c2137.64±0.89c57.74±0.84b73.23±1.57a59.22±0.84b62.11±0.61b64.24±1.09b

3 讨论

本实验证明，AFB1慢性中毒雏鸭肝细胞肿大，胆管上皮增生及空泡变性，胞质疏松，失去完整的细胞结构。血清中GOT，GPT，AKP活性升高，SOD活性显著下降， MDA含量大幅升高。“复方柴芩颗粒”高中低3种剂量组虽然也出现不同程度的胆管上皮增生、肝细胞肿大和轻微空泡变性等病变，但总体较模型组有缓解。一些血清生化酶和抗氧化应激指标是反映动物机体肝功能最重要最直接的指标，“复方柴芩颗粒”和亚硒酸钠能显著降低雏鸭AFB1慢性中毒引起的GOT，GPT，AKP活性升高趋势。显著升高SOD活性，降低MDA含量[12]。说明“复方柴芩颗粒”能有效地防治肉鸭黄曲霉毒素B1慢性中毒。

肝脏是动物体内、外源性物质代谢的主要场所，是物质的蓄积和解毒器官，是AFB1重要的靶器官。AFB1在体内的代谢转化与CYP450有密切关系。CYP450超家族参与外源性和内源性毒性物质的生物激活，还参与药物的氧化还原反应，促进药物、毒物的代谢[13]。整个超家族中参与外源性物质和毒物代谢的具体关键酶根据底物不同而不同。其中参与AFB1代谢的最主要的关键酶是CYP3A4[14]。

目前，关于AFB1对CYPs超家族中CYP3A4影响的研究最多，研究表明AFB1进入体内后，代谢酶CYP3A4被刺激呈逐渐升高的趋势[15]。而对其他亚型鲜有报道。本试验造模后第7，14，21天CYP2E1，CYP3A4，CYP1A2活性都显著升高，且活性均先升高后降低，在造模后第14天达到高峰。说明AFB1能显著升高CYPs活性，可能是因为体内外源性毒物AFB1进入体内，需要更多药物代谢酶代谢而引起活性升高。在AFB1慢性中毒过程是肝脏损伤逐渐加深，之后损伤降低或趋于稳定的状态。

不同中药对CYPs家族中不同基因型的成员活性影响不尽相同。在大鼠AFB1慢性中毒诱癌中，金花茶浓缩液显著降低了CYP3A4活性，提示我们金花茶降低肝损的机制是通过降低CYPs活性来减少前致癌物的代谢，从而降低由AFB1引起的化学性肝损伤，达到保护肝脏的作用[16]。同样，银杏叶提取物显著抑制CYP3A4活性，减少前致癌物代谢，达到保护肝组织的作用[17]。本次实验中，“复方柴芩颗粒”在造模后第7天和14天时能显著抑制CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性升高的趋势，而第21天，CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性有升高的趋势，且与模型组对比差异并不明显。对比已报道的文献推测原因可能是前期“复方柴芩颗粒”通过抑制CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性，减少AFB1前体物质代谢激活，降低其化学性肝脏损伤达到保护肝脏的作用。由于本实验室已经证明，“复方柴芩颗粒”高中低3种剂量组在用药后7～21 d能有效地防治肉鸭黄曲霉毒素B1慢性中毒[12]，所以本实验中用药第21天，CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性反而升高的原因可能是因为用药时间增加，代谢AFB1毒性的CYP450超家族也相应地增多来灭活和代谢体内增加的AFB1，从而降低AFB1对肝的损伤。在数值上分析，“复方柴芩颗粒”3种剂量组的CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性，高剂量组更接近于正常组，效果最好，但是3种剂量差异效果实际并不显著。

硒(Se)是生物体必需且毒性极强的微量元素，其本身比较特殊，具有一定的毒性，并且治疗剂量与中毒剂量非常接近。内服或注射剂量过大或多次连续使用，就会造成动物中毒[18]。国内外关于Se对CYP450的影响一直存在不一致的报道，其对CYP450不同亚型的影响不尽相同。Gregory等[19]的实验证明，在含AFB1 750 ng·g-1日粮中添加2.0 mg·kg-1的Se对CYP450无影响。另外一个实验显示，Se诱导老鼠肝脏细胞CYP2B活性，但对CYP1A无影响[20]。而本实验中亚硒酸钠组的3种酶活性在3个时间点上都高于正常组和AFB1组，说明Se诱导了CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性。由于无文献报道明确解释该现象，故推测原因可能是亚硒酸钠连续投用21 d，由于Se蓄积造成影响，使得CYPs不得不通过提高活性或含量来提高肝脏的自身代谢能力来清除包括硒在内的体内蓄积的毒素。

综上所述，本实验揭示了“复方柴芩颗粒”防治肉鸭AFB1慢性中毒的部分作用机理，即前期是通过抑制CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性减少AFB1前体物质代谢激活，降低化学性肝脏损伤。后期随着投用时间增加，中药组的AFB1被代谢成AFBO的量少，用药时间过长可能会使AFB1的量高于模型组，蓄积在体内的AFB1增多，此时“复方柴芩颗粒”启动激活CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性系统来代谢、灭活AFB1产物，达到降低肝损的目的。这也提示我们在与其他药物联合使用时要避免拮抗作用。

正如很多研究者所说，CYP450是一把双刃剑，它们既可以活化毒物，又可以灭活有害物质，因此，诱导与抑制CYP450活性与动物体损伤的发生或防治有很密切的关系[21]。这些特性使CYP450酶活性受到的影响呈现复杂性，再加上中药组方中几味中药配伍以及不同组分的作用使得CYP450的变化显得更加复杂。

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(责任编辑 卢福庄)

Effects of compound Chai Qin particles on enzymic activity of CYP450 in duck with aflatoxicosis

LI Yang， GAO Zhu， RONG Qian， YANG Xiao-min， ZHANG Rui， LI Ying-lun*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

An aflatoxin B1 (AFB1) poisoning model was firstly established in the present study. Ducks were divided into control group， Na2SeO3group， model group， low/medium/high-dose compound Chai Qin particles group. 7， 14， 21 d after treatment， liver tissues of ducks were taken to detect of the activities of CYP3A4， CYP1A2 and CYP2E1. Compared with model group， activities of CYP3A4， CYP1A2 and CYP2E1 in liver after 7， 14 d decreased significantly in three compound Chai Qin particles groups regardless of doses. Then， the activities of CYP3A4， CYP1A2 and CYP2E1 increased in these three groups after 21 d. But， there were no significant differences in the activities of CYP3A4， CYP1A2 and CYP2E1 among model group and compound Chai Qin particles groups. It was suggested that compound Chai Qin particles could effectively decrease activities of CYP1A2， CYP2E1 and CYP3A4 in the early treatment of aflatoxicosis by decreasing the activation of AFB1， which could reduce the chemical liver injury， and the increasing activities of CYP450 after 21 d treatment with compound Chai Qin particles might be caused by the increasing demand of CYP450 to metabolize AFB1.

cytochrome CYP1A2; cytochrome CYP3A4; cytochrome CYP2E1; compound Chai Qin particles; aflatoxin B1

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.06

2015-05-27

四川省科技厅重大项目(201378017)

李杨(1991—)，女，内蒙古满洲里人，在读硕士研究生，研究方向为中兽医与中兽药。E-mail：liyangkimi@163.com

*通信作者，李英伦，E-mail：liyinglun01@163.com

S834；S853.23

A

1004-1524(2016)01-0033-05

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):33-37

李杨，高祝，荣茜，等. 复方柴芩颗粒对鸭黄曲霉毒素慢性中毒CYP450酶活性的影响[J].浙江农业学报，2016，28(1):33-37.