分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞

蔡伟祥，方建凤，庄伟，李玉梅

（武警浙江总队嘉兴医院　消化内科，浙江　嘉兴　324000）

·论著·

分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞

蔡伟祥，方建凤，庄伟，李玉梅

（武警浙江总队嘉兴医院消化内科，浙江嘉兴324000）

目的：建立稳定的同时分离原代大鼠肝细胞（HC）、肝星状细胞（HSC）和Kupffer细胞（KC）的方法，并初步评估其在体外培养的特征。方法：通过胶原酶原位灌注获得肝脏单细胞悬液，随后行等密度离心结合选择性贴壁纯化肝脏原代细胞，细胞的产量和活力经自动细胞计数仪计算出，纯度经免疫荧光、特殊染色及吞噬等实验进行鉴定。结果：大鼠原代HC产量为（21.0±8.2）×106/g肝组织，活力为92.1%±2.1%，纯度为96.5%±2.2%；原代HSC产量为（2.5±0.8）×106/g肝组织，活力为90.1%±3.8%，纯度为93.1%±1.5%；原代KC产量为（4.1±1.2）×106/g肝组织，活力为96.2%±2.7%，纯度为95.1%±1.4%。分离的HC、HSC和KC适合体外长期培养。HSC在体外培养过程中失去维生素A，逐渐向成纤维细胞表型转变。KC在体外可增殖，至14 d时仍表达CD68，具有较强的吞噬能力。结论：成功建立同时分离和培养大鼠HC、HSC和KC的方法，为进一步研究肝脏病理生理提供细胞基础。

细胞分离；肝细胞；肝星状细胞；Kupffer细胞

肝脏是人体最大的消化腺，由肝细胞（hepatocyte，HC）和多种不同种类的非实质细胞（nonparenchymal cells，NPCs）组成［1］。HC大约占肝脏细胞总数的60%，而NPCs大约占总数的40%［2］。NPCs主要由肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells，SEC）、Kupffer细胞（Kupffer cells，KC）和肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）构成，分别占19%、15%和6%［2-3］。肝脏不仅是机体的代谢中心，而且在机体防御、控制激素水平、储存血液、调节血pH值、免疫调节等中发挥重要作用。HC构成肝脏的主体，是行使上述功能的主要细胞，也是多种肝损伤因素的主要靶点，其损伤将导致急慢性肝病。然而，多种肝脏病理生理，如药物性肝损害、脂肪肝、肝炎、肝纤维化和肝硬化，当最初的损伤因素作用于HC后，NPCs可能会继发地显著恶化最初的损伤［4-5］。因此，获取足够量的高活力和高纯度肝脏多种细胞是深入研究肝内细胞功能、信号转导、生理及病理过程的重要前提。目前已有HC和HSC的细胞系，但细胞系的一些生物学特性与原代细胞明显不同［6］。此外，目前关于同时分离肝脏多种细胞的报道不多。我们结合前期研究，采用胶原酶、等密度离心与选择性贴壁分离HC、HSC和KC，并对分离和培养后的一些特性进行鉴定。这种方法可以有效地分离肝脏HC、HSC和KC，为进一步研究肝脏生理和病理提供基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物与材料 雄性SD大鼠5只，购于上海交通大学医学院动物中心（JD201500123-1041），清洁级饲养至12周左右，体质量400～450 g用于实验。实验前12 h禁食，可自由饮水。

Nycodenz购于axis-shield公司；DMEM、Williams’ E、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、glutamine、penicillin-streptomycin、IV型胶原酶、自动细胞计数仪购于Invitrogen公司；糖原染色、油红O染色试剂盒购于南京建成生物研究所；细胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK-18）、神经胶质酸蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、CD68、α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）、Alexa Fluor 594驴抗小鼠二抗、Alexa Fluor 488羊抗兔二抗购于Abcam公司；聚苯乙烯微珠购于Sigma公司。

1.2 肝脏细胞分离

1.2.1 灌注悬浮液、等密度离心液与细胞培养液的配制：所有灌注液均行无菌过滤，实验前在39 ℃水浴箱中复温。灌注悬浮液的配方见表1，配方粉末购于上海生物工程有限公司。

Nycodenz用于配制等密度离心液。称取30 g Nycodenz粉末，加入80 mL GBSS/A液，磁力搅拌器加热溶解后，定容至100 mL，调pH值至7.4，配成30% Nycodenz储存液。

HC培养液为Williams’E+10% FBS+100 nmol/L dexamethasone+2 mmol/L glutamine+100 U/mL penicillin-streptomycin；HSC与KC培养液为DMEM+ 10% FBS+2 mmol/L glutamine+100 U/mL penicillinstreptomycin。

1.2.2 肝脏单细胞悬液获取：戊巴比妥（5 mg/100 g）腹腔注射麻醉大鼠。大鼠头部以下部位浸泡75%酒精30 s，以保持相对无菌。行腹部正中切口，充分暴露肝脏。大鼠胃肠组织拨向腹腔左侧，于22G留置针门静脉穿刺后固定。灌注预热的EGTA液10 min（速率为15 mL/min）后，灌注含0.5 mg/mL IV型胶原酶的灌注液15 min，速率为15 mL/min。切断肝脏与周围组织的联系，剔除血管、筋膜，在10 cm培养皿内剪碎，倒入三角烧瓶内，加入含0.5 mg/mL胶原酶的酶消化液50 mL，于37 ℃中振荡消化30 min。取出消化液，经200目尼龙网滤过，以下操作在4 ℃下进行，除非特别说明。

表1 肝细胞灌注悬浮液配方（mg/L）

1.2.3 HC纯化与培养：将所过滤的消化液平均分到4个50 mL离心管中，每管补GBSS/B至40 mL。以50×g离心2 min，悬液移至另外无菌离心管中用于HSC和KC分离。收集细胞沉淀于一新的50 mL离心管，GBSS/B液悬浮，再行50×g离心2 min，取细胞沉淀。上述离心过程再重复2次，以去除死细胞和细胞碎片。取细胞沉淀悬浮于HC培养液中，调细胞计数为5×105/mL，种植于胶原包被的6孔板中。37 ℃培养箱中孵育4 h后，首次换液，以后每2 d换液1次。

1.2.4 HSC纯化与培养：将收集的HSC和KC悬液，于4 ℃，500×g离心7 min后，弃上清，留取细胞沉淀。合并沉淀物于50 mL无菌离心管内，再次离心，取细胞沉淀，加入8.2%的Nycodenz混匀（用30% Nycodenz储存液与GBSS/A配制），上覆少许GBSS/B，行密度梯度离心（1 500×g离心17 min）。离心结束后取界面处细胞，用GBSS/B离心清洗2次（500×g离心7 min）。取细胞沉淀悬浮于HSC培养液中，调细胞计数为5×105/mL，24 h后首次换液，以后每48 h换液1次。

1.2.5 KC分离与纯化：梯度离心取出界面处细胞后，其余部分加入等体积的GBSS/B液，混匀，用GBSS/B离心清洗2次（500×g离心7 min）。无血清DMEM悬浮细胞沉淀，调细胞计数为1×106/mL，种植于10 cm培养皿中，细胞培养箱孵育。30 min后，吸出DMEM，GBSS/B液轻柔洗3次，去除未贴壁细胞，此时更换为KC培养基。以后每48 h换液1次。细胞换液及培养的一般操作遵循规范化的标准［7］。

1.3 细胞产量与活力 应用自动细胞计数仪计算细胞量与活力。100 μL细胞悬液与等量0.4%台盼蓝（V/V）混合，取10 μL混合液加入细胞计数板，将计数板插入到计数仪卡槽内，按“细胞计数”将自动得到细胞的总量、活细胞数、死细胞数和细胞活力。

1.4 特殊染色

1.4.1 糖原染色：糖原染色用于鉴定HC与NPCs内糖原颗粒。新分离与培养7 d或14 d的HC、HSC、KC种植于圆形无菌载玻片上。贴壁后95%酒精固定15 min，蒸馏水洗1 min，自然晾干。滴加过碘酸酒精染液室温避光孵育10 min，流水冲洗5 min；滴加Schiff氏液覆盖玻片，室温孵育15 min，流水冲洗1 min，自然晾干。滴加苏木精染核30 s，流水冲洗5 min，中性树胶封片。

1.4.2 油红O染色：油红O染色用于鉴定HC与NPCs细胞内是否含有脂滴。细胞贴壁后4%多聚甲醛固定15 min，纯水洗3次，加入新鲜配制的油红O工作液（3份储存液+2份纯水）作用15 min后，纯水洗5次，随后，苏木素复染30 s，水溶性封片剂封片镜检。

1.5 自发荧光 维生素A可自发蓝绿色荧光。HSC储有维生素A，因此，采用荧光显微镜在328 nm波长下观察HSC。

1.6 免疫荧光 为评估细胞的表型，新分离和培养7 d或14 d的HC、HSC和KC种植在圆形无菌载玻片上。PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定20 min后，PBS洗3次，0.5% trixon X-100通透5 min，PBS洗3次，孵育5% BSA 1 h阻止非特异性染色。随后，4 ℃孵育一抗CK-18（1∶100稀释，PC标志）、GFAP（1∶200，静止HSC标志）、CD68（1∶200，KC标志）、α-SMA（1∶200，活化HSC标志）24 h。PBS洗后，加入Alexa Fluor 594驴抗小鼠二抗或Alexa Fluor 488羊抗兔二抗37℃孵育30 min。再用PBS洗3次，DAPI染核3 min，PBS清洗1次，荧光抗淬灭剂封片，激光共聚焦下拍照。随机选择10个视野计算染色阳性的细胞和总的蓝色细胞核数，重复3次。

1.7 吞噬聚苯乙烯微珠 KC具有吞噬外来异物的功能。激发波长为470荧光标记的聚苯乙烯微珠与培养基1∶250混合与新分离和培养的HC和NPCs孵育60 min，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，DAPI染色3 min，荧光抗淬灭剂封片，激光共聚焦成像。

2 结果

2.1 HC分离、培养和鉴定 HC因密度和体积明显高于NPCs，低速离心（50×g）2 min可使大部分HC与NPCs分离［2］。经Countess自动细胞计数仪得出平均HC产量为（21.0±8.2）×106/g肝组织，活力为92.1%±2.1%，见表2。新分离的HC多为圆形或卵圆形，细胞核染色质明显，胞核突出，随着体外培养时间的延长，培养7 d的HC逐渐失去立方型结构，形态类似扁平的成纤维细胞。糖原染色显示新分离的HC胞浆含有大量的红色颗粒。随机选择10个视野计算CK-18染色阳性的细胞和总的蓝色细胞核数，并独立重复3次，显示染色阳性细胞96.5%±2.2%。培养7 d时，HC失去上皮表型，开始退化或向成纤维化表型转变，但胞浆仍含有大量的红色糖原颗粒，CK-18表达仍为阳性。见图1。

表2 分离的单个肝脏细胞的量、活力与纯度（±s）

表2 分离的单个肝脏细胞的量、活力与纯度（±s）

细胞类型量（×106/g肝组织）活力（%）纯度（%）HC21.0±8.292.1±2.196.5±2.2 HSC 2.5±0.890.1±3.893.1±1.5 KC 4.1±1.296.2±2.795.1±1.4

2.2 HSC分离、培养和鉴定 HSC因胞质内含有大量维生素A，又称储脂细胞，其密度在所有肝脏细胞中最轻，8.2% nycodenz梯度离心可有效悬浮HSC。新鲜分离的HSC经Countess自动细胞计数仪得出平均HSC产量为（2.5±0.8）×106/g肝组织，活力为90.1%±3.8%（见表2）。初分离的HSC呈圆形，体积较小，胞内含折光性较强的脂滴，在328 nm激发光下可见易淬灭的蓝色自发荧光。油红O染色显示新分离贴壁1 d的HSC胞浆内含大量红色脂滴。随机选择10个视野计算GFAP染色阳性的细胞和总的蓝色细胞核数，并独立重复3次，显示染色阳性细胞93.1%±1.5%。培养14 d的HSC失去脂滴，油红O染色及328 nm自发荧光阴性，自发转化为成纤维细胞，表达特征性标志α-SMA。见图2。

图1 HC鉴定

2.3 KC分离、培养和鉴定 KC细胞种植在普通培养皿中30 min后，PBS清洗3次，去除未贴壁细胞。0.5%胰酶-EGTA消化贴壁的KC，经Countess自动细胞计数仪得出每皿的细胞数，再乘以种植的总皿数，平均KC产量为（4.1±1.2）×106/g肝组织，活力为96.2%±2.7%（见表2）。KC贴壁4 h类似不规整圆形，随机选择10个视野计算CD68染色阳性的细胞和总的蓝色细胞核数，并独立重复3次，显示染色阳性细胞95.1%±1.4%。吞噬聚苯乙烯微珠共聚焦成像显示贴壁4 h的KC有强烈的吞噬能力，几乎所有的细胞均吞噬含荧光标记的微珠。KC培养24 h后含有细长条型，带有细长的尾丝，形态不规则，4 d出现含有多核的巨细胞，至14 d时仍为这种形态。培养至14 d时，KC仍具有吞噬能力，且表达CD68。见图3。

3 讨论

随着体外肝脏细胞的共培养和肝脏组织工程的开展，为精确地研究各种肝脏细胞特定的功能，分离足量的高活力、高纯度肝脏细胞是必要的。分离肝脏细胞的策略可分为2种：①单一地分离HC或NPCs；②同时分离HC和NPCs。单独分离某种肝脏细胞已有报不少报道［2，8］，但同时分离肝脏多种细胞的文献却不多。

目前HC和NPCs的细胞分离方法，主要依据EGTA/胶原酶两步法，先组织灌注，后低速离心［9-10］。正常HC周围细胞外基质成分很少，因此门静脉灌注0.05%的胶原酶可以很容易地分离HC。HC为多边形上皮细胞，占肝脏细胞总数的60%左右，直径20～30 μm，密度在1.10至1.14 g/mL之间，直径和密度在肝脏细胞中最大［11］，因此，低速离心可有效地初步沉淀HC。HC体积较大，易受灌流液、剪切力等损伤，活力常不高。本研究中HC量、活力和纯度分别为（21±8.2）×106/g肝组织、92.1%±2.1%、96.5%± 2.2%，这与先前的研究［2，8］无明显差别。HC在体外培养过程中，虽然仍表达CK-18，储有糖原，但形态上类似成纤维细胞。

HSC位于SEC与HC之间的Disse腔，占肝脏细胞总数的6%，直径10～12 μm，因胞内含大量的维生素A，故密度在肝脏细胞中最轻，约为1.04～1.05 g/ mL［12-13］。FACS分选虽然可提供高纯度的HSC，但这种方法的产量很低［14］。当前，密度梯度仍是分离HSC的主要方法。密度梯度可在1.067～1.053 g/mL之间选择，但低密度1.053 g/mL（8.2%）可提高纯度。HSC密度较低主要是因细胞内含有大量脂滴，但是营养、年龄等会影响HSC脂滴的水平。研究［13］显示老龄或富含维生素A营食的动物，HSC含脂滴较多，本研究选择的是400～450 g的老龄大鼠，新分离的HSC平均得量为（2.5±0.8）×106/g肝组织，活力为90.1%±3.8%，纯度为93.1%±1.5%。换算成总量，分离量接近理想状态4×107～5 ×107/大鼠［14］；活力与纯度与Pfeiffer等［9］和Liu等［10］的研究相当。HSC在体外培养过程中，细胞脂滴逐渐丧失，向成纤维细胞转化，表达其特征指标α-SMA。

图2 HSC鉴定

KC是肝脏的常驻巨噬细胞，构成体内最大的组织常驻巨噬细胞群，占肝脏细胞总数的15%，直径在10～12 μm之间，密度为1.06～1.08 g/mL［8］。KC贴壁速度快，常在30 min内完成［15-16］，本研究先贴壁30 min，PBS清洗未贴壁细胞后换液。KC的量、活力、纯度分别为（4.1±1.2）×106/g肝组织、96.2%±2.7%、95.1%±1.4%，细胞量及纯度足够用于下游实验。最近有研究［15，17］报道了原代混合HC培养分离的方法，经随后的分离传代可获得较高量和纯度的KC，这简化了KC分离，但这不适合同时分离肝脏多种细胞。KC的来源有2种可能：肝脏局部KC的增殖和循环的骨髓起源的单核细胞的募集［18］。本研究显示KC可在体外增殖，培养14 d的KC亦表达CD68，具有吞噬功能，间接提示KC至少部分来源于肝脏局部KC的增殖。

本研究表明在胶原酶灌注基础上联用等密度离心、选择性贴壁可以分离较高活力和纯度的大鼠HC、HSC和KC。本法的最大优点在于可以同时分离肝脏3种细胞，而且培养的细胞在体外可单层长期培养。然而，本研究也有不足之处，首先，HC体外培养我们未模拟体内的3D培养，而3D培养可延缓HC去分化和功能丧失［19-20］；其次，HC与NPCs以及NPCs之间的稳定共培养体系的建立还需进一步的实验。

图3 KC鉴定图

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（本文编辑：丁敏娇）

Isolation, identification and cultivation ofhepatocytes, hepatic stellate cells and Kupffer cells from rats

CAI Weixiang， FANG Jianfeng， ZHUANG Wei， LI Yumei. Department of Gastroenterology， Jiaxing Hospital of Zhejiang Armed Police Corps， Jiaxing， 324000

Objective: To establish a protocol for isolation， identification and cultivation of hepatocytes（HC）， hepatic stellate cells （HSC） and Kupffer cells （KC） from rats. Methods: By combining in situ perfusion with collagenase， density gradient centrifugation and selective adhension， primary HC， HSC and KC were obtained. Cell yield and viability were assessed by automated cell counter. The purity of these cells were detected with immunofl uorescent staining， special staining and phagocytosis assay. Results: The average yield， viability and purity of isolated HC were （21.0±8.2）×106/per gram liver， 92.1%±2.1%， and 96.5%±2.2%， respectively. The average yield， viability and purity of isolated HSC were （2.5±0.8）×106/per gram liver， 90.1%±3.8%， and 93.1%±1.5%， respectively. The average yield， viability and purity of isolated KC were （4.1±1.2）×106/per gram liver， 90.1%±3.8%， and 95.1%±1.4%， respectively. The isolated cells could be cultured in vitro for long-term. HSC underwent a gradual phenotypic transition to a myofibroblast-like phenotype with vitamin A losing in vitro culture. KC could proliferate， and had the ability of phagocytosis， and the expression of CD 68 at 14 d of culture. Conclusion: The simultaneous method is feasible to isolate and culture primary rat HC， HSC， and KC.

cell isolation； hepatocyte； hepatic stellate cell； Kupffer cell

·论著·

R575.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.09.004

2015-09-12

蔡伟祥（1978-），男，江苏江阴人，主治医师。