乙醇回流法提取甜菜树总黄酮及其抗氧化性评价

杨申明，王　波，陈　靖，王振吉，江　岸，张明兰

（楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000）

乙醇回流法提取甜菜树总黄酮及其抗氧化性评价

杨申明，王波，陈靖，王振吉*，江岸，张明兰

（楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000）

以甜菜树为原料，总黄酮提取率为考察指标，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化乙醇回流法提取总黄酮的最佳工艺条件，并就总黄酮对1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2-·）的清除作用进行了初步研究。结果表明，甜菜树总黄酮最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数85%，料液比1∶40（g/mL），提取温度80℃，提取时间180 min，在该提取工艺条件下，得到甜菜树总黄酮平均提取率为1.67%。总黄酮质量浓度在0.009 3～0.046 5mg/mL时，对DPPH·、·OH、O2-·的清除率可分别达到88.39%、91.47%、46.29%，说明甜菜树总黄酮具有较强的体外抗氧化活性。

甜菜树；总黄酮；提取工艺；抗氧化性

甜菜树［Yunnanopilia longistaminea（W.Z.Li）C.Y. Wu etD.Z.Li］属山柚子科（Opiliaceae）甜菜树属（Yunnanopilia）植物［1］，主要分布于云南红河、云南东南部、广西西南部等地海拔1100～1400m的河谷、沟谷密林中［2-3］。云南民间常采其花序及嫩茎、嫩叶炒食、做汤或腌制食用，其味道鲜甜爽口，风味独特，是当地非常受欢迎的一种特色野生蔬菜。有研究表明，甜菜树中含有17种以上氨基酸，各种氨基酸含量及嫩茎叶中粗纤维、粗脂肪、粗蛋白质、总糖、总酸及碳水化合物和VC的含量均比一般蔬菜高［4-5］。可见，甜菜树是一种营养价值较高，开发前景较大的野生植物资源。

黄酮类化合物具有广泛的生物活性和重要的药用价值，而且可作为食品、化妆品的天然添加剂，如甜味剂、抗氧化剂、食用色素等［6-7］，因此对黄酮类化合物的提取及活性研究受到国内外的广泛关注。

目前，对甜菜树的研究主要集中在营养成分［4］、甜味特殊功能［8］、抗氧化活性研究［9］、核型研究［2］和组织培养技术［5，10］等方面，尚未见有关甜菜树总黄酮的含量测定、提取工艺及抗氧化性等方面的相关报道。本试验以甜菜树为原料，总黄酮提取率为考察指标，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化乙醇回流法提取总黄酮的最佳工艺条件。同时，以VC为对照，研究总黄酮对1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2-·）的清除能力，旨在为更好地开发利用甜菜树资源提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与设备

1.1.1材料与试剂

甜菜树嫩茎叶，采于云南省双柏县；芦丁标准品（纯度≥98%），由中国药品生物制品检定所提供；无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、30%过氧化氢、硫酸亚铁、水杨酸、焦性没食子酸、抗坏血酸、1，1-苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）等均为国产分析纯，水为实验室自制超纯水。

1.1.2仪器与设备

UV-2100型紫外-可见分光光度计，CP214C型电子天平，HH-2型恒温水浴锅，SHZ-ⅢA型循环水式真空泵，202-00型电热鼓风干燥箱。

1.2方法

1.2.1处理方法

将新鲜的甜菜树嫩茎叶依次用自来水、蒸馏水洗净风干后，置于55℃烘箱中烘干，粉碎后过40目筛，得甜菜树干粉，备用。

1.2.2甜菜树总黄酮含量的测定

用芦丁作为标准品，采用Al（NO3）3-NaNO2分光光度法测定甜菜树中总黄酮的含量［11］。所得线性回归方程A=11.231C-0.005 9（R2=0.999 88）。结果表明，吸光度与芦丁质量浓度具有良好的线性关系，因此，可用于甜菜树总黄酮含量的测定。总黄酮提取率计算公式为：

式中：C为根据回归方程计算出的总黄酮浓度（mg/mL）；V为定容体积（mL）；N为稀释倍数；M为甜菜树样品质量（g）。

1.2.3甜菜树总黄酮提取工艺流程

甜菜树嫩茎叶→粉碎→过40目筛→称量→乙醇回流提取→抽滤→定容→测量

1.2.4甜菜树总黄酮提取工艺的单因素试验

在预试验的基础上，分别考察以下各因素对甜菜树总黄酮提取率的影响：①在提取温度80℃，提取时间120min，料液比1∶40（g/mL）条件下，选择乙醇体积分数分别为45%、55%、65%、75%、85%进行比较；②在乙醇体积分数75%，提取时间120min，提取温度80℃条件下，选择料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、

1∶50、1∶60（g/mL）进行比较；③在乙醇体积分数75%，料液比1∶40（g/mL），提取时间120min条件下，选择提取温度分别为50、60、70、80、90℃进行比较；④在乙醇体积分数75%，料液比1∶40（g/mL），提取温度80℃条件下，选择提取时间分别为60、90、120、150、

180min进行比较。确定各因素对甜菜树总黄酮提取率的影响作用，每组试验重复3次。

1.2.5甜菜树总黄酮提取工艺参数优化

在单因素试验的基础上，选择乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间为主要影响因素，以甜菜树总黄酮提取率为考察指标，通过L9（34）正交试验优化乙醇回流法提取甜菜树总黄酮的最佳工艺条件。正交试验因素和水平见表1。

1.2.6甜菜树总黄酮抗氧化活性测定

1.2.6.1对DPPH·的清除作用

［12-13］的方法，稍作改动。向2.5mL2×10-4mol/L的DPPH溶液中加入质量浓度分别为0.0093、0.0186、0.0279、0.0372、0.0465mg/mL的甜菜树黄酮溶液1.0mL，反应30min后于波长517nm处测定吸光度，记为Ai；相同方法测定2.5mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液与1.0mL无水乙醇混合溶液的吸光度，记为Ac；并测定2.5mL无水乙醇与质量浓度分别为0.009 3、0.018 6、0.027 9、0.037 2、0.046 5mg/mL的甜菜树黄酮溶液1.0mL混合后的吸光度，记为Ab。同时，以VC作阳性对照，甜菜树总黄酮对DPPH·清除率计算公式为：

表1　L9（34）正交试验因素水平表Table 1　Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.2.6.2对·OH的清除作用

［14-15］的方法，稍作改动。在5支25mL比色管中加入9mmol/L的硫酸亚铁和9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液各2.0mL，分别加入质量浓度为0.009 3、0.018 6、0.027 9、0.037 2、0.046 5mg/mL的甜菜树黄酮溶液1.0 mL，再加8.8 mmol/L的过氧化氢溶液2.0mL，用蒸馏水定容至10mL，置于37℃水浴中反应30min后，于波长510 nm处测吸光度，记为AX；以不加过氧化氢的甜菜树黄酮提取液的吸光度记为AX0；以不加黄酮的对照吸光度记为A0；同时，以VC作阳性对照。甜菜树总黄酮对·OH的清除率计算公式为：

1.2.6.3对O2-·的清除作用

参考刘长建等［16］的方法，稍作改动。在5支25mL比色管中均加入 50 mmol/L的 Tris-HCI缓冲液（pH=8.2）4.5mL，超纯水4.2mL，再分别加入质量浓度为0.009 3、0.018 6、0.027 9、0.037 2、，0.046 5 mg/mL的甜菜树黄酮溶液1.0mL，混匀，于25℃水浴中恒温反应20min后，加入0.3mL已预热（25℃）的3mol/L的邻苯三酚（以0.3mL浓度为10mmol/L的盐酸代替作参比），迅速混匀，于波长325 nm处每隔30 s测一次吸光度，到5min为止，计算吸光度随时间的变化率FX；取一支25mL比色管不加甜菜树黄酮溶液，按上述步骤加入试剂后，测定吸光度，计算吸光度随时间的变化率F0。同时，以VC作阳性对照，甜菜树总黄酮对O2-·的清除率计算公式为：

1.2.7数据处理

试验数据采用Excel2003软件作图和分析处理。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1乙醇体积分数对甜菜树总黄酮提取效果的影响

由图1可以看出，乙醇体积分数为45%～75%时，甜菜树总黄酮提取率随乙醇体积分数的增大而逐渐升高；当乙醇体积分数为75%时，提取率达到最高，为1.62%；之后随乙醇体积分数的增大，甜菜树总黄酮提取率下降。这可能是由于乙醇体积分数太大，甜菜树中的色素、脂溶性物质等大量溶出，从而影响甜菜树总黄酮的溶出。因此，确定适宜的乙醇体积分数为75%，选择乙醇体积分数为65%、75%和85%进行正交试验。

2.1.2料液比对甜菜树总黄酮提取效果的影响

由图2可以看出，料液比1∶20～1∶40（g/mL）时，甜菜树总黄酮提取率随提取溶剂添加量的增大而增大；当料液比为1∶40（g/mL）时，提取率达到最高，为1.61%；之后随提取溶剂添加量的增大，甜菜树总黄酮提取率逐步下降。这种趋势的形成可能是由于随着溶剂量的增加，有利于甜菜树中总黄酮的溶出；而溶剂用量过大时，升温速度变慢，不利于甜菜树中总黄酮的溶出。因此，确定适宜的料液比为1∶40（g/mL），选择料液比为1∶30、1∶40和1∶50（g/mL）进行正交试验。

2.1.3提取温度对甜菜树总黄酮提取效果的影响

由图3可以看出，提取温度为50～80℃时，甜菜树总黄酮提取率随温度的升高而逐渐增大；当提取温度为80℃时，提取率达到最高，为1.64%；之后随提取温度的升高，甜菜树总黄酮提取率下降。其原因可能是提取温度过高，使乙醇浓度降低，减少甜菜树中黄酮类物质的溶出，同时提取温度过高，也会破坏甜菜树的黄酮结构，导致提取率下降。因此，确定适宜的提取温度为80℃，选择提取温度为70、80和90℃进行正交试验。

2.1.4提取时间对甜菜树总黄酮提取效果的影响

由图4可以看出，提取时间为60～150min时，甜菜树总黄酮提取率随时间的延长而升高；当提取时间为150min时，提取率最大，为1.67%；之后继续延长提取时间，甜菜树总黄酮提取率下降。这可能是回流提取时间过短，甜菜树中总黄酮不能充分溶出，提取率不高；但回流提取时间过长，甜菜树总黄酮在长时间的高温下受热分解，导致提取率下降。因此，确定适宜的提取时间为150min，选择提取时间为120、150和180min进行正交试验。

2.2正交试验结果

由表2可知，影响甜菜树总黄酮提取率的主次顺序为：C＞B＞A＞D，即提取温度＞料液比＞乙醇体积分数＞提取时间。甜菜树总黄酮的最佳提取工艺参数为：A3B2C2D3，即乙醇体积分数85%，料液比1∶40（g/mL），提取温度80℃，提取时间180min。由于试验中没有出现最优组合，故在该条件下进行验证性试验，重复5次，测得甜菜树总黄酮平均提取率为1.67%，相对标准偏差（RSD）为1.03%，表明该方法重复性良好，试验数据可靠，适合于甜菜树中总黄酮的提取。

表2　正交试验结果Table 2　Results of the orthogonal experiment

2.3甜菜树总黄酮抗氧化性分析

2.3.1甜菜树总黄酮清除DPPH·的能力评价

DPPH·是一种稳定自由基，当待测溶液中含有抗氧化物时，抗氧化物能提供一个电子与DPPH·配对，使DPPH·特征紫色逐渐消失，可根据DPPH·的褪色程度来间接评价抗氧化物的抗氧化能力［17］。由图5可以看出，随着甜菜树总黄酮质量浓度的增加，其清除DPPH·的能力逐渐增强，即清除率与总黄酮质量浓度间存在一定的量效关系。在甜菜树总黄酮质量浓度0.009 3～0.018 6mg/mL范围内，对DPPH·的清除率大于VC；在总黄酮质量浓度0.018 6～0.046 5mg/mL范围内，甜菜树总黄酮清除DPPH·的能力稍弱于VC，但其依然表现出较强的清除DPPH·的能力。

2.3.2甜菜树总黄酮清除·OH的能力评价

·OH是一种重要的活性氧，能与细胞中的分子发生反应对机体造成损伤，清除·OH的能力是评价抗氧化物的重要指标［18］。由图6可以看出，随着甜菜树总黄酮质量浓度的增加，清除·OH的能力逐渐增强，即清除率与黄酮质量浓度间也存在一定的量效关系。甜菜树总黄酮质量浓度为0.009 3mg/mL时，对·OH的清除率大于VC；总黄酮质量浓度为0.0186～0.046 5mg/mL时，对·OH的清除率与VC很接近，说明甜菜树总黄酮具有较强的清除·OH的能力。

2.3.3甜菜树总黄酮清除O2-·的能力评价

O2-·可通过邻苯三酚在弱碱介质中自氧化产生，并生成有色中间产物，黄酮类化合物能够抑制O2-·的形成，可通过检测有色中间产物的生成量，测定黄酮对O2-·的清除能力。黄酮类化合物能够与O2-·结合形成稳态自由基，终止自由基链反应，而发挥抗氧化作用［19-20］。由图7可以看出，甜菜树总黄酮质量浓度为0.009 3～0.027 9mg/mL时，随着甜菜树总黄酮质量浓度的增加，其清除O2-·的能力增强；当总黄酮质量浓度为0.027 9～0.046 5mg/mL时，随着甜菜树总黄酮质量浓度的增加，其清除O2-·的能力减弱。当总黄酮质量浓度为0.009 3～0.037 2mg/mL时，对O2-·的清除率明显大于VC，表明甜菜树总黄酮具有一定的清除O2-·的能力。

3　结论与讨论

（1）采用乙醇回流法提取甜菜树总黄酮，经过正交试验优化后得到的最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数85%，料液比1∶40（g/mL），提取温度80℃，提取时间180min。在此最佳工艺条件下进行验证性试验，得到甜菜树总黄酮的平均提取率为1.67%，相对标准偏差为1.03%。说明该提取工艺准确度高、重复性好，可用于甜菜树总黄酮的提取。

（2）本研究利用比色法，分别从清除DPPH·、·OH和O2-·三个方面测定了甜菜树总黄酮的抗氧化活性。结果表明，甜菜树总黄酮对DPPH·、·OH和O2-·有较强的清除能力，在总黄酮质量浓度0.009 3～0.046 5mg/mL范围内，对DPPH·、·OH的清除能力随甜菜树总黄酮质量浓度的增加而增强，并有量效关系；在总黄酮质量浓度0.009 3～0.027 9mg/mL范围内，随甜菜树总黄酮质量浓度的增加，清除O2-·能力增强；总黄酮质量浓度在0.009 3～0.046 5mg/mL时，对DPPH·、·OH、O2-·的清除率可分别达到88.39%、91.47%、46.29%，说明甜菜树总黄酮具有较强的体外抗氧化活性。

（3）甜菜树总黄酮是一种良好的天然抗氧化剂，具有广泛的开发前景和利用价值。相关研究结果对甜菜树总黄酮的提取及抗氧化活性成分的开发和利用具有重要意义。由于本研究仅对甜菜树总黄酮进行体外抗氧化活性评价，因此，今后有必要在此基础上对甜菜树总黄酮的体内抗氧化活性进行研究，为开发安全性高的天然抗氧化剂和保健产品提供科学依据和参考。

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Extraction of Total Flavonoids from Yunnanopilia longistam inea by EthanolReflux M ethod and Evaluation of Its Antioxidant Activity

YANG Shen-ming，WANG Bo，CHEN Jing，WANG Zhen-ji*，JIANG An，ZHANGMing-lan
（DepartmentofChemistry and Life Science，Chuxiong NormalUniversity，Chuxiong675000，China）

In order to increase the extraction rate of total flavonoids，the ethanol reflux extraction conditions of total flavonoids from Yunnanopilia longistaminea was optimized by L9（34）orthogonal test based on the single-factor tests. Meanwhile，the antioxidant effects of obtained total flavonoids on 1，1-phenyl-2-base of the radical（DPPH·），hydroxyl radical（·OH）and superoxide anion radical（O2-·）were studied.The results showed that，the optimum extraction parameters were:the volume fraction of ethanol as extractantwas 85%，ratio of solid to liquid was 1∶40（g/mL），extraction temperature was 80℃，and extraction time was 180 min.Under the extraction conditions，the average extraction rate of total flavonoids from Yunnanopilia longistaminea was 1.67%.When the total flavonoids concentration was in the range of 0.009 3 to 0.046 5mg/mL，the clearance rate of total flavonoids on DPPH·，·OH and O2-·were 88.39%，91.47%and 46.29%，respectively，implying suchmaterial had a strong antioxidantactivity in vitro.

Yunnanopilia longistaminea；total flavonoids；extraction process；antioxidant properties

TQ914.1

A

10.3969/j.issn.1009-6221.2016.04.011

国家自然科学基金青年项目（31300370）；云南省高校科技创新团队建设项目（IRTSTYN）；云南省省级重点学科建设项目（05YJJSXK03）；楚雄师范学院教改项目（1510）

杨申明（1976—），男，汉族，本科，实验师，主要从事天然有机产物化学研究及教学工作。

王振吉，博士，副教授，研究方向：天然产物化学。

2016-03-02