氯沙坦对自发性高血压大鼠肾脏组织Bax、Bcl-2表达的影响情况

陈宝琅，李睿

氯沙坦对自发性高血压大鼠肾脏组织Bax、Bcl-2表达的影响情况

陈宝琅1，李睿1

目的探讨氯沙坦对自发性高血压（SHR）大鼠肾脏组织Bcl-2相关性蛋白X（Bax）和B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）表达的影响。方法选取近交系雄性SHR大鼠30只和Wistar-Kyoto雄性大鼠15只，SHR大鼠随机分为氯沙坦组（n=15）和SHR阳性对照组（n=15），氯沙坦组按氯沙坦30 mg/kg灌胃，SHR阳性对照组按0.9%氯化钠溶液10 ml/kg灌胃，Wistar-Kyoto大鼠作为正常对照组，按0.9%氯化钠溶液10 ml/kg灌胃，每日清晨灌胃，连续灌胃8周。比较各组大鼠尾动脉收缩压，采用免疫组化染色法检测两组Bax和Bcl-2蛋白表达，采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测Bax和Bcl-2 mRNA表达水平。结果氯沙坦组给药第4周和8周尾动脉收缩压明显低于给药前收缩压水平（P＜0.05）；氯沙坦组给药第4周和8周尾动脉收缩压低于SHR阳性对照组（P＜0.05）；氯沙坦组和正常对照组Bcl-2平均光密度分别为（0.19 ±0.01）和（0.20±0.02 ），明显高于SHR阳性对照组（P＜0.05），而Bax平均光密度分别为（0.12± 0.02）和（0.13±0.01），明显低于SHR阳性对照组（P＜0.05）；氯沙坦组和正常对照组Bax和Bcl-2平均光密度比较差异无统计学意义（P＞0.05）；Bcl-2和Bax mRNA相对表达量在氯沙坦组和正常对照组间差异比较无统计学意义（P＞0.05），SHR阳性对照组患者的Bcl-2相对表达值显著高于氯沙坦组和正常对照组，而Bax mRNA相对表达值显著低于氯沙坦组和正常对照组（P＜0.05）。结论氯沙坦对SHR大鼠有明显的降压作用，可抑制Bax基因及蛋白表达，而促进Bcl-2基因及蛋白表达。

氯沙坦；自发性高血压；大鼠；Bax；Bcl-2

高血压是一种以动脉压升高为特征，可伴有心脏、血管、脑和肾脏等器官功能性或器质性改变的全身性疾病，其发病率较高，在我国约有2亿高血压病患者，可占全球高血压病总人数的1/5［1］。高血压的发病原因有很多，高龄、高盐摄入、肥胖、遗传和环境因素都可能直接或间接的导致高血压的发生，绝大多数高血压患者病因不明，称为自发性高血压（SHR）［2］。长期高血压会导致肾小动脉硬化，并引起夜尿，多尿、尿中含蛋白、管型及红细胞等临床症状［3］。研究表明［4］，高血压肾病的发生和发展过程与肾脏组织细胞凋亡因子Bax和Bcl-2的表达有密切的联系，Bcl-2可抑制细胞凋亡的发生，而Bax却可以促进细胞的凋亡，二者的比例在细胞凋亡中发挥着重要作用。 氯沙坦可以阻断血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）与其受体结合， 进而影响Bax和Bcl-2相关蛋白的表达，并抑制细胞的凋亡，从而保护肾脏的功能，但其机制目前尚不清楚。

为了进一步探讨氯沙坦对自发性高血压大鼠肾脏组织Bcl-2相关性蛋白X（Bax）和B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）表达的影响，本研究对进行氯沙坦灌胃的SHR大鼠的尾动脉收缩压、Bax和Bcl-2表达情况与进行氯化钠溶液灌胃的SHR大鼠和正常大鼠进行比较分析，为临床上提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验动物选取近交系雄性SHR大鼠30只，清洁级11周龄，体重120～140 g，同时选取Wistar-Kyoto雄性大鼠15只，体重110～140 g。实验大鼠均由中科院上海实验动物中心提供。

1.2实验分组SHR大鼠随机分为2组，氯沙坦组和SHR阳性对照组，其中氯沙坦组按氯沙坦30 mg/kg灌胃，SHR阳性对照组按0.9%氯化钠溶液10 ml/kg灌胃。Wistar-Kyoto大鼠作为正常对照组，按0.9%氯化钠溶液10 ml/kg灌胃。三组大鼠均于每日清晨灌胃，连续灌胃8周。

1.3检测方法

1.3.1仪器与试剂荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司FS-7900型）；显微镜（日本奥林巴斯公司125型）；电热恒温培养箱（上海金坛仪器公司HH-25）。兔抗大鼠Bax和Bcl-2单克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG以及DAB显色试剂盒（北京陆桥科技有限公司）；Trizol试剂盒和PCR定量试剂盒（美国TaKaRa公司）。

1.3.2免疫组化染色及阳性鉴定所有组织作常规4 μm蜡状切片，以兔抗大鼠Bax或Bcl-2单克隆抗体按1：50稀释后作为一抗，以生物素化羊抗兔IgG按1：100稀释后作为二抗，并以PBS代替一抗作阴性对照。染色成功后加DAB显色，并以光镜观察阳性信号。

1.3.3PCR检测方法采用Trizol试剂盒提取肾脏组织内RNA，逆转录后采用荧光定量PCR仪和PCR定量检测试剂盒进行Bax和Bcl-2的定量分析，具体检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4统计学处理数据处理分析采用SPSS19.0软件。计量资料采用（±s）表示，组间比较使用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠尾动脉收缩压比较氯沙坦组和SHR阳性对照组给药前尾动脉收缩压明显高于正常对照组（P＞0.05）；氯沙坦组给药第4周和8周尾动脉收缩压分别为（143.08±16.04）mmHg和（146.27±17.10）mmHg（1 mmHg=0.133kPa），明显低于给药前水平（P＜0.05）；氯沙坦组给药第4周和8周尾动脉收缩压低于SHR阳性对照组（P＜0.05）（表1）。

2.2免疫组织化学染色Bax和Bcl-2表达阳性反应物定位于细胞浆，呈棕黄色颗粒，Bax和Bcl-2主要定位于肾小管上皮细胞，肾小球也有少量表达。各组Bax和Bcl-2表达免疫组化染色图，见图1。正常对照组Bcl-2平均光密度分别为（0.20± 0.02 ），明显高于SHR阳性对照组，而Bax平均光密度分别为（0.13±0.01），明显低于SHR阳性对照组，差异比较有统计学意义（P＜0.05）；氯沙坦组Bax平均光密度为（0.12±0.02），较SHR阳性对照组降低，而Bcl-2平均光密度为（0.19± 0.01），较SHR阳性对照组升高，差异比较无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

2.3各组大鼠Bcl-2、Bax mRNA相对表达量SHR阳性对照组的Bcl-2相对表达值显著高于正常对照组，而和Bax mRNA2相对表达值显著低于正常对照组（P＜0.05）；氯沙坦组Bcl-2较SHR阳性对照组有所降低，Bax mRNA较SHR阳性对照组有所升高（P＜0.05）（表3）。

3　讨论

高血压病是最常见的慢性病之一，发病率较高，多发于中老年人群，严重影响人们的生活质量［4］。持续过高的血压可造成患者的心脏、血管、脑和肾脏等器官功能性或器质性的改变，引起中风、心脏病、血管瘤、肾衰竭等疾病，甚至造成死亡［5］。高血压病因很多，多与环境和遗传因素有关，但大多数病因不明，称为自发性高血压［6］。高血压对肾脏的损害主要是造成肾小动脉硬化，并引起夜尿，多尿、尿中含蛋白、管型及红细胞等临床症状［7］。有研究表明［8］，肾小动脉的硬化与肾实质细胞的减少有密切的关系，而细胞凋亡因子Bax和Bcl-2的表达在这一过程中发挥着重要作用，Bax蛋白的高表达和Bcl-2的低表达能明显促进肾实质细胞的凋亡，进而促进肾病的发展。

表1　各组大鼠尾动脉收缩压比较（±s　，mmHg）

表1　各组大鼠尾动脉收缩压比较（±s　，mmHg）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与本组给药前比较，bP＜0.05；与SHR阳性对照组比较，cP＜0.05

组别　只数　给药前　给药第4周　给药第8周正常对照组　15　120.11±12.30　119.05±13.01　120.91±12.27 SHR阳性对照组　15　161.08±15.81a　159.83±17.12a　160.45±16.13a氯沙坦组　15　160.12±13.27a　143.08±16.04abc　146.27±17.10abcF值　-　16.843　17.346　16.556 P值　-　＜0.05　＜0.05　＜0.05

图1　各组Bax和Bcl-2表达免疫组化染色图（1：正常对照组Bax表达；2：SHR阳性对照组Bax表达；3：氯沙坦组Bax表达；4：正常对照组Bcl-2表达；5：SHR阳性对照组Bcl-2表达；6：氯沙坦组Bcl-2表达）

表2　各组Bax和Bcl-2蛋白表达的平均光密度值（±s）

表2　各组Bax和Bcl-2蛋白表达的平均光密度值（±s）

注：与SHR阳性对照组比较，aP＜0.05

组别　n　Bax　Bcl-2正常对照组　15　0.13±0.01a　0.20±0.02aSHR阳性对照组　15　0.20±0.01　0.12±0.01氯沙坦组　15　0.12±0.02a　0.19±0.01aF值　-　9.227　8.943 P值　-　＜0.05　＜0.05

表3　各组大鼠的Bcl-2、Bax mRNA相对表达量（±s）

表3　各组大鼠的Bcl-2、Bax mRNA相对表达量（±s）

注：与SHR阳性对照组比较，aP＜0.05

组别　n　Bcl-2　Bax正常对照组　15　0.47±0.09a　0.31±0.01aSHR阳性对照组　15　0.62±0.11　0.24±0.03氯沙坦组　15　0.46±0.07a　0.32±0.02at值　-　11.462　12.069 P值　-　＜0.05　＜0.05

细胞凋亡主要是指细胞在多种死亡信号刺激后发生的一系列主动性细胞死亡过程，其在机体的生长、发育和维持内部平衡过程中起着重要的作用［9］。细胞凋亡在各种生理和病理过程均较为常见，且具有非常重要的生物学意义，其与细胞增殖的动态平衡可维持细胞群体数量的自身稳定，并清除癌变细胞、自身反应免疫细胞及病毒感染细胞等进行机体防御，而细胞凋亡的紊乱或可导致或促进多种疾病的发生［10］。细胞凋亡过程与相关基因的调节和控制有关，而Bcl-2家族的Bcl-2和Bax是目前研究最多的凋亡基因［11］。Bcl-2蛋白是一种膜整和蛋白，是最重要的凋亡抑制基因， 但对细胞周期和分化并不产生影响［12］。Bax可对抗Bcl-2蛋白的抑制凋亡作用，其过度表达能促进细胞凋亡，而Bcl-2与Bax蛋白的动态平衡进一步调节了细胞凋亡的过程［13］。

有研究表明［14］，氯沙坦作为一种血管紧张素Ⅱ受体1阻断剂能影响高血压性肾病患者的细胞凋亡过程，其能有效改善肾内血流以缓解肾小球内的高压，减少凋亡的发生；其还能抑制AngⅡ与其胞膜受体结合，防止细胞内钙离子的聚集，进一步防止凋亡的发生。但也有研究表明，氯沙坦降低肾内细胞凋亡的作用方式与其对肾组织内Bax和Bcl-2蛋白的调节有关，经氯沙坦治疗的大鼠内Bcl-2蛋白表达明显升高，而Bax蛋白表达明显降低，这与本研究的研究结果基本一致。本研究将选取的近交系雄性SHR大鼠随机分为氯沙坦组和SHR阳性对照组，并分别实施氯沙坦和0.9%氯化钠溶液灌胃，将其尾动脉收缩压、Bax和Bcl-2表达情况与正常大鼠进行比较分析。研究结果表明，氯沙坦组给药第4周和8周的尾动脉收缩压低于给药前水平，且明显低于SHR阳性对照组，说明氯沙坦能明显改善肾内血流，并有效的缓解肾小球内的高压。通过免疫组织化学染色观察 Bax和Bcl-2蛋白表达情况发现，氯沙坦组和正常对照组Bcl-2平均光密度明显高于SHR阳性对照组，而Bax平均光密度明显低于SHR阳性对照组；进一步对各组大鼠Bcl-2、Bax mRNA相对表达量进行定量分析发现，氯沙坦组Bcl-2较SHR阳性对照组有所降低，Bax mRNA较SHR阳性对照组有所升高，提示氯沙坦可能会促进Bcl-2蛋白的表达并抑制Bax的表达，进而下调Bax/Bcl-2的比例，减少肾脏组织细胞的凋亡，从而保护患者的肾脏功能。但本研究限于研究样本的不足，对氯沙坦促进Bcl-2蛋白表达和抑制Bax蛋白表达的机制仍需做进一步深入的研究。

综上所述，氯沙坦对SHR大鼠有明显的降压作用，可抑制Bax基因及蛋白表达并促进Bcl-2基因及蛋白表达，从而下调Bax/Bcl-2比例，进一步保护肾脏功能，但其影响机制仍需进一步研究。

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本文编辑：刘璐鑫，田国祥

The effect of losartan on the expression of Bax and Bcl-2 in renal tissue of SHR rats

CHEN Bao-lang*， LIRui.*Department of physiology， Heze Medical College， Heze， Shandong， 274000， China.

CHEN Bao-lang， E-mail: 836905865@qq.com

ObjectiveTo investigate the effect of losartan on expression of Bax and Bcl-2 in renal tissue of spontaneously hypertensive （SHR）rats. Methods30 male SHR rats and 15 male Wistar-Kyoto rats were selected. SHR rats were randomly divided into two groups： losartan group （n=15） and SHR positive control group （n=15），losartan group was administered losartan 30 mg/kg by gavage； SHR positive control group was administered 10mL/ kg of 0.9% sodium chloride solution by gavage； as normal control group， Wistar-Kyoto rats were administered 10 mL/kg of 0.9% sodium chloride solution by gavage. All the rats were intragastrically administered every morning for 8 weeks. We compared systolic blood pressure of each group， expression of Bax and Bcl-2 in two groups were detected by immunohistochemical staining. The level of Bax mRNA and Bcl-2 mRNA were detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR）. ResultsTail artery systolic pressure of losartan group after administered 4 weeks and 8 weeks was significantly lower than before administration （P<0.05）. Tail artery systolic pressure of losartan group after administered 4 weeks and 8 weeks was significantly lower than SHR positive control group （P<0.05）. The average optical density of Bcl-2 in losartan group and normal control group were （0.19 ±0.01） and （0.20±0.02） respectively， which were significantly higher than SHR positive control group （P<0.05）. The average optical density of Bax in losartan group and normal control group were（0.12±0.02） and （0.13±0.01）respectively， which were significantly lower than SHR positive control group （P<0.05）. There was no significant difference in average optical density of Bax and Bcl-2 between the losartan group and the normal control group（P＞0.05）. As to relative expression of Bcl-2 mRNA and Bax mRNA， there was no significant difference between losartan group and the normal control group（P＞0.05）. The relative expression of Bcl-2 mRNA in SHR positive control group was significantly higher than losartan group and the normal control group； but the relative expression of Bax mRNA in SHR positive control group was significantly lower than Losartan group and the normal control group （P<0.05）. ConclusionLosartan has a significant effect on the reduction of blood pressure in SHR rats， which can inhibit the expression of mRNA and protein of Bax， and promote the expression of mRNA and protein of Bcl-2.

Losartan； Spontaneously hypertensive； Rats； Bax； Bcl-2

•论著•

R544.1

A

1674-4055（2016）08-0965-03

1274000菏泽，山东省菏泽市医学专科学校生理学教研室

陈宝琅，E-mail：836905865@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.08.22