肉桂酸预处理通过激活Akt信号通路对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

郝霁萍，高宇勤，贺少辉，赵国平

•论著•

肉桂酸预处理通过激活Akt信号通路对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

郝霁萍1，高宇勤1，贺少辉1，赵国平2

目的探讨肉桂酸预处理对大鼠心肌细胞Akt信号通路及心肌缺血再灌注损伤的影响。方法30只雄性SD大鼠，随机分为三组，每组各10只，分别为假手术组（只开胸不结扎前降支）、缺血再灌注组、药物预处理组。采用了结扎SD大鼠心脏冠状动脉前降支的方法建立在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，利用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，利用蛋白印迹（Western blot）技术探究肉桂酸预处理对Akt信号通路的影响。结果 肉桂酸药物预处理组与缺血再灌注组比较，心肌细胞凋亡指数明显减少（P＜0.05）；肉桂酸预处理能促进p-Akt蛋白（磷酸化Akt）的表达，增加BCL-2表达，对非磷酸化Akt无明显影响。结论 肉桂酸预处理能减少SD大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型的心肌细胞凋亡，其机制可能通过促使Akt磷酸化，从而增加BCL-2蛋白的表达，抑制细胞凋亡来发挥保护作用。

肉桂酸；心肌缺血再灌注损伤；磷酸化蛋白激酶B

缺血再灌注损伤病理过程涉及到凋亡等机制，通过减少再灌注心肌细胞的凋亡有助于减轻再灌注后心肌损伤。有研究发现，Akt信号通路激活后，可增加BCL-2表达，进一步抑制Caspase3激活，减少和稳定线粒体膜通透转换孔的开放，抑制心肌细胞凋亡［1，2］。肉桂酸是从肉桂皮分离出来的有机酸，减轻心肌缺血再灌注损伤，其作用机制可能与氧化应激损伤有关［3］，但对于心肌缺血灌注损伤的心肌细胞凋亡影响未见文献报道。本研究提出一个假说，肉桂酸预处理能减轻心肌缺血再灌注损伤，那么其机制是否可能与减少心肌细胞凋亡有关？而且此机制是否通过干预Akt信号通路发挥作用？为了验证此假说，本研究采用在体SD大鼠冠状动脉前降支（LAD）结扎术模型来观察肉桂酸预处理对SD大鼠心肌缺血再灌注损伤的心肌保护作用及与Akt信号通路的关系。

1　材料和方法

1.1主要试剂与仪器肉桂酸购于南京泽朗医药科技有限公司（批号ZL2008009RGS）， anti-Akt（抗鼠一抗）抗体，anti-pAkt（ser473）抗体（抗鼠一抗），购置于Cell signaling公司，BCL-2、DAPDH（内参）购自SANTA CRUZ生物技术公司，TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（KGA7032）购于凯基生物有限公司。Westernblot蛋白印迹电泳仪（美国 Bio-rad公司），TS-2000A脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司），生物医学实验处理系统（成都泰盟生物科技公司）。

1.2动物模型的建立SPF 级雄性SD（30只）大鼠，体重280～400 g，月龄5～10月，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2008-0002。将大鼠称重，注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，固定于手术台，颈部备皮，碘伏消毒，纵形剪开颈部皮肤约2～3 cm，分离皮下组织及肌肉，显露气管，钝性分离气管，行气管插管，接呼吸机，调整呼吸频率60 次/min、通气量20 ml/kg。胸骨左缘3 mm纵形剪开皮肤约4 cm，钝性分离皮下、胸大肌与前锯肌，于三肋间逐步剪开肋间肌，撑开肋骨，撕破心包，显露心脏，确定缝扎位置（肺动脉圆锥与左心耳交界处下方2 mm，前降支近端位置）。用0号线，叠一个0.8～1 mm的凹槽硅胶管，出针打结结扎前降支，缺血30 min，松开结扎，复灌2 h。模型复制的可靠性用ECGⅡ导联的变化来判断，以ST段抬高为心肌缺血存在，以ST段回落1/2为再灌注成功（图1）。本实验建模总共有5只SD大鼠因为麻醉和手术原因死亡，死亡率16%。

图1　SD大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立成功的心电图表现

1.3分组及给药方案肉桂酸与生理盐水混合，于灌胃前加热溶解混均，药物预处理组大鼠给予肉桂酸400 mg/kg灌胃，灌胃一天一次，连续灌胃4 d，最后一次于手术前30 min给予。实验共分为3组，30只雄性SD大鼠被随机分为3组，每组10只，实际建模成功是每组8只大鼠，三组分别为：假手术组（只开胸不结扎前降支）、缺血再灌注组、药物预处理组。

1.4心肌TUNEL凋亡原位检测及步骤再灌注结束，迅速剪下心脏，置于冰PBS 中洗净残血；分离左心室前壁缺血边缘区，于10%的中性甲醛固定12 h，然后制作石蜡切片。严格按照TUNEL试剂盒方法进行操作。阳性细胞核呈棕黄色，阴性细胞核呈蓝色，每张切片于缺血部位随机选取8个高倍视野（×400倍），分别记数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数并进行汇总，以凋亡心肌细胞数占心肌细胞总数的百分比作为凋亡指数=凋亡细胞数/心肌细胞

1.5蛋白印迹（Western blot）检测配制分离胶的配制浓度：8%和12%分离胶，制备5%浓缩胶，上液蛋白总量120 μg，进行电泳。转膜条件：Akt、p-Akt、BCL-2蛋白检测用350 mA恒流湿转45 min。一抗孵育条件：anti-Akt（1：1000），Anti-GAPDH（1：2000），Anti-p-Akt（1：500）， Anti-BCL-2（1：500），4℃孵育过夜，二抗（1：5000）。将Western blot ECL发光液A、B 各500μL等量混合后，涂在PVDF膜上，覆盖胶片，在暗房中，曝光，扫描仪扫描Western blot图像，Quantity one软件分析Western blot条带的灰度值。

1.6统计学处理使用 SPSS13.0 统计软件进行统计学处理。实验数据采用均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05时认为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肉桂酸预处理对缺血再灌注损伤模型大鼠心肌细胞凋亡的影响实验中发现肉桂酸药物预处理组凋亡指数为0.17±0.04，与缺血再灌注组相比较，明显降低心肌细胞凋亡指数（P＜0.05），差异具有统计学意义（表1，图2）。

表1　肉桂酸预处理对心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡指数影响（±s）

表1　肉桂酸预处理对心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡指数影响（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与缺血再灌注组比较，bP＜0.05

组别　n　凋亡指数假手术组　8　0.06±0.02缺血再灌注组　8　0.32±0.07a药物预处理组　8　0.17±0.04ab

图2　肉桂酸预处理对SD大鼠心肌细胞凋亡的影响（×200，TUNEL法）

2.2肉桂酸预处理对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠心肌细胞Akt信号通路的影响结果显示，肉桂酸预处理组能诱导Akt蛋白磷酸化，p-Akt（ser473）在肉桂酸药物预处理组中明显升高，和缺血再灌注组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.01），发现与缺血再灌注组比较，肉桂酸预处理能升高BCL-2（Akt信号通路的下游蛋白）表达（P＜0.01），肉桂酸预处理对于总Akt（非磷酸化Akt）蛋白无明显影响（图3）。

3　讨论

目前，急性心肌梗死再灌注治疗是一种重要的治疗方法，缺血再灌注损伤可造成心肌细胞凋亡、心肌细胞氧化应激损伤及炎症反应，上述原因造成心功能的下降、恶性心律失常的发生以及猝死［1］。防治心肌缺血再灌注损伤成为目前急需要解决的问题。

图3　肉桂酸预处理对SD大鼠心肌细胞Akt信号通路的影响（药物预处理组与假手术组比较，aP＜0.01；药物预处理组与缺血再灌注组相比，bP＜0.01）

心肌缺血再灌注损伤一个重要机制是心肌细胞凋亡，研究发现调控PI3K/Akt信号通路可以抑制心肌细胞凋亡，发挥保护作用。当Akt被激活后，其上调下游的BCL-2，抑制Caspase3激活，减少mPTP（线粒体膜通透转换孔）开放，以避免和减少线粒体内细胞色素C及凋亡诱导因子的释放，从而抑制心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用［2，4］。肉桂酸是从肉桂皮分离出来的有机酸。有研究发现肉桂酸和芍药苷、甘草酸、阿魏酸混合液可以通过激活微血管内皮细胞释放eNOS（内皮型一氧化氮合酶）进而减轻氧化应激损伤［5］。研究提示肉桂酸能降低MDA，升高SOD以减轻心肌细胞的氧化应激损伤［3］，肉桂酸和阿魏酸及甘草酸混合液可以抑制NF-κB信号通路的激活，减轻炎症反应［6］。以上研究发现肉桂酸是一个能防治心肌缺血再灌注损伤的药物，但是机制研究还很欠缺，特别是对心肌细胞凋亡的影响目前未见报道。因此本实验目的就是观察肉桂酸预处理能否通过激活PI3K/Akt信号通路拮抗心肌细胞凋亡进而减轻心肌缺血再灌注损伤。本实验采用在体SD大鼠冠状动脉LAD结扎术在体实验模型，利用TUNEL技术，观察肉桂酸预处理对缺血再灌注损伤模型大鼠心肌细胞凋亡的影响，发现肉桂酸预处理能明显降低模型大鼠心肌细胞凋亡指数，说明肉桂酸确实能减少心肌细胞凋亡。进一步本实验利用蛋白印迹（Western blot）技术检测心肌组织中的Akt、p-Akt（ser473）、BCL-2，发现磷酸化Akt［p-Akt（ser473）］在肉桂酸预处理组中明显升高，而且在此组中BCL-2也明显上调，Akt是PI3K信号通路的上游关键蛋白，Akt被配体后，可以继续激活下游BCL-2蛋白，由此激发抗凋亡机制，本实验结果确认了实验假设。

综上所述，本研究显示肉桂酸预处理对缺血再灌注损伤大鼠模型心肌的保护作用部分是通过激活PI3K/Akt信号通路，上调BCL-2，减少心肌细胞凋亡发挥心肌保护作用。本研究结果提示肉桂酸将是一种有前途的防治心肌缺血再灌注损伤的药物。但是本研究只是通过在体证明肉桂酸抗凋亡作用及与PI3K信号通路相关，还需要通过离体实验证实，也需要电镜下凋亡的客观形态，此类问题有待于进一步研究。

［1］Hausenloy DJ，Yellon DM. Survival kinases in ischemic preconditioning and postconditioning［J］. Cardiovasc Res，2006，70（2）：240-53.

［2］Tian Y，Piras BA，Kron IL，et al. Adenosine 2B Receptor Activation ReducesMyocardial Reperfusion Injury by Promoting Anti-Inflammatory Macrophages Differentiation via PI3K/Akt Pathway［J］. Oxid Med Cell Longev，2015，16（6）：585-95.

［3］陈非，傅延龄，邹丽琰，等. 肉桂酸对心缺血再灌注损伤的保护作用［J］. 中国医药学报，1999，14（1）：68-9.

［4］Erik H，Lars B，Bj S，et al. Intermittent Insulin Treatment Mimics Ischemic Postconditioning via MitoK-ATP Channels， ROS and RISK［J］. Scand Cardiovasc J，2015，49（5）：270-9.

［5］Qian GQ，Peng X，Cai C，et al. Effect on eNOS/NO Pathway in MIRI rats with preconditioning of GFPC from Dang Gui Si Ni decoction［J］. Pharmacognosy Res，2014，6（2）：133-7.

［6］Gao Y，Hao J，Zhang H，et al. Protective effect of the combinations of glycyrrhizic， ferulic and cinnamic acid pretreatment on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats［J］. Exp Ther Med.2015，9（2）：435-45.

本文编辑：刘畅，田国祥

Protective effect of cinnamic acid preconditioning in the myocardial ischemia reperfusion injury of ratsby activating Akt signal pathway

HAO Ji-ping*， GAO Yu-qin， HE Shao-hui， ZHAO Guo-ping.*Imaging department， Xi'an Ninth Hospital， Xi'an， 710054， China.

GAO Yu-qin； E-mail: 2101749095@qq.com

Objective To explore the effect of cinnamic acid preconditioning on Akt signal pathway and in myocardial ischemia reperfusion injury of rats. Methods 30 male SD rats were randomly divided into three groups：sham operation group （Thoracotomy was accomplished with no anterior descending branch ligation）， ischemia reperfusion group， and drug preconditioning group. Myocardial ischemia reperfusion injury model was established by ligating the left anterior descending coronary artery. The apoptosis index of cardiomyocyte was observed by TNUEL（terminal- deoxynucleotidyl-transferase - mediated dUTP-biotin nick end labeling）. Western blot technology was used to explore the effects of cinnamic acid preconditioning on Akt signal pathway. Results Compared with ischemia reperfusion group， apoptosis index of drug preconditioning group was significantly decreased （P<0.05）. Cinnamic acid pretreatment could increase expression of the phosphorylation Akt （p-Akt） and BCL-2 protein， but had no effect on non-phosphorylation Akt. Conclusion Cinnamic acid preconditioning could reduce apoptosis of cardiomyocyte in myocardial ischemia reperfusion injury model of SD rats. It may induce phosphorylation of Akt，increase expression of BCL-2 and preventing cardiomyocyte apoptosis.

Cinnamic acid； Myocardium ischemia reperfusion injury； Phosphorylated protein kinase B

R541.4

A

1674-4055（2016）08-0932-03

国家自然科学基金（81173189）；西安市卫生局科技项目及西安市科技项目（SF1416）

1710054西安，西安市第九医院影像科；2510632广州，暨南大学医学院

高宇勤，E-mail：2101749095@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.08.11