奥曲肽对LPS处理的A549细胞代谢的影响*

阮骆阳， 徐小红， 潘凤娟， 钟翠鸣， 田小华， 杨彩兰， 李雅兰

(1暨南大学附属第一医院，广东 广州 510632； 2广东省农垦中心医院，广东 湛江 524002)



奥曲肽对LPS处理的A549细胞代谢的影响*

阮骆阳1，2， 徐小红2， 潘凤娟2， 钟翠鸣2， 田小华2， 杨彩兰2， 李雅兰1△

(1暨南大学附属第一医院，广东 广州 510632；2广东省农垦中心医院，广东 湛江 524002)

目的： 探讨生长抑素衍生物奥曲肽对脂多糖(LPS)诱导A549细胞代谢组学变化的影响。方法: 体外培养肺泡腺癌上皮细胞A549，分别经LPS和LPS+奥曲肽处理，气相色谱质谱联用技术(gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS)和液相色谱质谱联用技术(liquid chromatography/mass spectrometry, LC/MS)检测A549细胞在不同处理条件下的代谢组变化，对结果进行色谱图可视化检查，将相应数据进行主成分分析(PCA)，解析其差异表达代谢物，并构建互作网络图。结果：(1) 在基于LC/MS方法的代谢组分析中，发现不同处理组之间有一定差异，进一步采用正交潜变量投影判别分析(OPLS-DA)，获得差异性表达代谢物。差异代谢物以氨基酸类及磷脂类为主。(2)通过GC/MS技术分析不同处理A549细胞的代谢组，获得差异性表达代谢物，主要为有机酸，糖类及氨基酸类代谢产物。(3)构建互作网络图，主要涉及糖酵解/糖异生、色氨酸代谢、半乳糖代谢、尿素循环和柠檬酸代谢，并从中发现14个具有标志性代谢物作用的关键成分，包括5-羟色胺、吲哚、苏氨酸、丝氨酸、葡萄糖、苯丙氨酸、乳糖、延胡索酸盐、4-羟基苯乳酸、冬氨酸盐、天门冬素、腐胺、脯氨酸和琥珀酸盐。结论：(1) 代谢组分析发现，在奥曲肽处理LPS刺激的A549细胞的过程中，有机酸，糖类、氨基酸类和脂类是其变化的主要成分。 (2) 构建了LPS致A549细胞炎症反应和奥曲肽干预作用的差异代谢物互作网络图，涉及5个代谢路径和14个关键代谢组分。

A549细胞； 奥曲肽； 脂多糖； 代谢组

脓毒症是急性肺损伤发生的最重要原因，脓毒症感染时革兰氏阴性菌细胞壁外层释放脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)，LPS与细胞表面受体相互作用，活化炎症细胞，可导致上皮细胞、内皮细胞等生理屏障的结构损伤和功能紊乱。脓毒症相关急性肺损伤至今仍无有效的防治措施，临床上一般采取的是呼吸机机械通气为主的支持治疗，但过度的机械通气所产生的机械张力本身就可以引起肺部炎症，并可导致肺损伤。

奥曲肽(octreotide,OQT)是人工合成的生长抑素的八肽衍生物，具有广泛的抗炎抗增殖活性，对急性胰腺炎有显著抗炎作用和治疗效果[1]；对粘连性肠梗阻疾病的炎症反应具有抑制作用[2]；动物实验发现,奥曲肽联合灯盏花素能减轻急性胰腺炎相关的肺损伤，抑制血清和肺组织中淀粉酶、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等水平[3]；可能通过影响NF-κB信号通路的活化，进而下调促炎因子的产生和表达，对2,4,6三硝基苯磺酸诱导的大鼠溃疡性结肠炎发挥治疗作用[3]。奥曲肽与天然的生长抑素具有相同的药理作用，经皮下给药其效果远优于生长抑素，可抑制生长激素等多种激素的分泌，结合其抗炎作用，提示奥曲肽具有广泛的临床应用前景。

在前期的研究基础上，本研究对生长抑素奥曲肽处理LPS刺激的A549细胞进行代谢组分析，探讨生长抑素奥曲肽对LPS处理的A549细胞代谢组学变化的影响。

材 料 和 方 法

1 细胞

人肺腺癌上皮细胞系A549细胞购于ATCC。

2 主要试剂

DMEM培养基、血清、双抗均购自Gibco；胰酶购自HyClone，LPS、奥曲肽购自Sigma；DMSO购自MPBIO；LC/MS级乙腈、高效液相色谱(HPLC)级甲醇购自Merck；甲酸购自CNW。实验用水为屈臣氏蒸馏水。

3 主要方法

3.1 细胞培养及分组 从液氮中取出A549细胞，迅速置于37 ℃恒温水浴锅中，缓慢摇动溶解后加入10倍体积培养基，混匀，离心，去掉上清液，用新鲜的培养基重悬细胞，于含 10%胎牛血清，100 U/L青霉素和链霉素的DMEM培养液5 mL，在 37 ℃、5%CO2氧化碳培养箱中培养。1～2 d更换1次培养基，3～5 d传代1次，待细胞铺满瓶底85%～95%时，胰酶消化并离心收集细胞用于后续实验。共有细胞样本4例，分为LPS组、LPS+OQT组、control组和OQT组，其中LPS剂量为200 μg/L,OQT剂量为1.5 mg/L，每组均6例重复。

3.2 液相色谱质谱联用技术(liquid chromatography/mass spectrometry,LC/MS)代谢组学检测样品处理 样本常温下解冻后，移液枪精准移取100 μL样本至1.5 mL的离心管，采用甲醇沉淀蛋白，样本∶甲醇比例为1∶3，充分涡旋30 s，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；小心取出离心管，移取200 μL上清液，转入进样小瓶。

3.3 气相色谱质谱联用技术(gas chromatography/mass spectrometry,GC/MS)代谢组学检测样品处理 取细胞37 ℃水浴解冻，1 000 r/min离心5 min，去掉上清液(将同组2管细胞合并)，残渣中加入700 μL冰冷甲醇，涡旋30 s，超声提取10 min，静止，12 000 r/min(4 ℃)离心10 min，取上清液于另一 EP管中，向残渣中再加700 μL冰冷甲醇，重复上述操作，取上清与之前上清液合并。取200 μL上清液于进样小瓶中(1管样品分别取入6个EP管中)，置温和氮气下吹干；向玻璃衍生小瓶中加入30 μL的20 g/L甲氧胺盐酸吡啶溶液，强烈振荡30 s，于37 ℃肟化反应90 min；取出后加入30 μL的双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺[bis-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide，BSTFA； 含1%三甲基氯硅烷(trimethylchlorosilane，TMCS)]的衍生试剂，于70 ℃反应60 min。取出样本，室温放置30 min，进行GC/MS代谢组学检测。

3.4 LC/MS分析 本实验的仪器分析平台为Agilent LC-Q/TOF-MS (1290 Infinity LC, 6530 UHD and Accurate-Mass Q-TOF/MS)，分离色谱柱为C18色谱柱。色谱分离条件为：柱温为40 ℃；流速0.4 mL/min；流动相组成A(水+0.1%甲酸)、B(乙腈+0.1%甲酸)；进样量为4 μL，自动进样器温度4 ℃。

3.5 GC/MS分析 采用Agilent 7890A/ 5975C GC-MS的气质联用分析平台，进行样本的代谢组数据采集。毛细管色谱柱为Agilent的HP-5ms。仪器参数设定为：进样口温度280 ℃，EI离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，高纯氦气(纯度大于99.999%)作为载气，不分流进样，进样量1.0 μL。升温程序为：初始温度80 ℃，维持2 min，10 ℃/min的速度升至320 ℃，并维持6 min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为30～600 m/z。采用随机顺序进行连续样本分析，避免因仪器信号波动而造成的影响。

4 统计学处理

LC/MS分析所得数据用Mass Profiler软件(Agilent)进行预处理，并在Excel 2007软件中进行后期编辑，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量(rt_mz，即保留时间_质荷比)、观察量(样本)和峰强。本项目样本在正模式下共得到555个features，负模式下获得752个features。然后将所有数据归一化到总信号积分。将编辑后的数据矩阵导入Simca-P 13.0 软件进行主成分分析(principal component analysis，PCA)。

GC/MS分析所得数据在R软件平台下采用XCMS软件包进行预处理，并在Excel 2007软件中进行后期编辑，去除包括来自于柱流失和样本制备过程引起的杂质峰，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量(rt_mz，即保留时间_质荷比)、观察量(样本)和峰强。本项目样本共得到3 169个碎片离子。然后将所有数据归一化，将编辑后的数据矩阵导入Simca-P 13.0软件进行主成分分析。

寻找差异性表达代谢物采用正交潜变量投影判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)模型的VIP值(阈值>1)，并结合t检验的P值分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 原始色谱图的可视化检查

对QC样品的总离子流色谱图进行重叠。初步观察发现仪器的保留时间重现性非常好，仪器稳定，因而提高了仪器分析和数据结果的可靠性，见图1、2。

Figure 1.LC/MS total ion current chromatographic analysis of QC (qality control) sample.

图1 LC/MS分析QC样本总离子流色谱图

Figure 2.GC/MS total ion current chromatographic analysis of qality control (QC) sample.

图2 GC/MS分析质量控制QC样本总离子流色谱图

2 总PCA 分析

对样本进行主成分分析能从总体上反映2组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小。在Simca-P软件正式分析前，对数据组进行格式化(unit variance scaling, UV)和平均中心化(mean-centered)处理，以获得更加直观且可靠的结果。为了判别2组之间是否具有差异，我们采用 PCA建模方法对样本进行分析。本分析在正模式下共获得3个主成分，累积R2X=0.411，Q2=0.142；负模式下共获得4个主成分，累积R2X=0.423，Q2=0.0422。PCA得分图如图3、4所示。对于PCA这种非监督性模型分析来说，判别模型质量好坏的主要参数为R2X，该值代表模型的解释率。一般来说该值大于0.4就表示该模型可靠。PCA分析是一种非监督性的模型分析方法，相对于监督性的模型分析方法如PLS-DA来说，PCA更可靠地反映不同组之间的最真实差异。

Figure 3.LC/MS analysis of two groups of PCA and chart.n=6.

图3 LC/MS分析2组的PCA得分图

Figure 4.GC/MS analysis of two groups of PCA and chart.n=6.

图4 GC/MS分析2组的PCA得分图

3 基于LC/MS组之间差异性代谢产物的挖掘及鉴定

差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库(http://metlin.scripps.edu/)比较质谱的质荷比或者精确分子质量。LPS、control 2组的差异性代谢物，正模式下明确8种，其中LPS组相对于control组增高的有氨基马尿酸盐，降低的有十七酰甘油磷酸化胆碱、甲基丁醇肉毒碱、生物素、吲哚、油酰胺、泛酸、尿苷；负模式下发现11种，其中LPS组相对于control组增高的有门冬酰胺和苹果酸，降低的有腺苷硒高胱氨酸、叶酸、糖酸、羟苯基乳酸、L-门冬酰胺、L-苯丙氨酸、己烯酰辅酶A、色氨酸和泛醌。明确正模式下LPS、LPS+OQT两组之间差异性代谢物5种，LPS+OQT组较LPS组增高的有胆碱，降低的有氨酰二氢(神经)鞘氨醇、脱氧鸟苷酸(dGMP)、棕榈酰丙氨酸和5-羟色胺。发现负模式下LPS、LPS+OQT 2组之间差异性代谢物13种，LPS+OQT组较LPS组增高的有叶酸、乙酰神经氨酸、琥珀酰二胺基庚二酸、腺苷甲基氧化丁醇、硒高胱氨酸、琥珀酸、α-右旋葡萄糖，降低的有谷氨酰磷酸、苹果酸、肌醇、糖酸、鱼泡酸、腺苷硒高胱氨酸。

4 基于GC/MS方法组之间差异性代谢产物的挖掘及鉴定

差异性代谢物的定性方法为：通过检索NIST数据库进行鉴定。发现LPS、LPS+OQT 2组之间差异性代谢物16种，LPS+OQT组较LPS组增高的有α羟基异丁酸、戊基邻苯二甲酸盐、己酸、松二糖、庚酸、L-门冬氨酸、壬酸，降低的有脯氨酸、苯乙基一甲胺、苹果酸、乳糖、延胡索酸、D-葡萄糖、四糖呋喃、吡喃葡萄糖、丙氨酸；发现LPS、control 2组之间差异性代谢物19种， LPS组较control组增高的有D-葡萄糖、苯丙氨酸和脯氨酸，降低的有尿嘧啶、苏氨酸、硬脂酸、丝氨酸、腐胺、磷酸、壬酸、异亮氨酸、庚酸、松二糖、胆固醇、尸胺、戊基邻苯二甲酸盐、羟基异丁酸和丁烯醇。

讨 论

LPS作用于细胞表面的Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)诱导一系列的炎症反应。随着全身炎症反应失控致器官功能障碍理论的迅速发展，在本质上急性肺损伤基本被认为是一种炎症性疾病，是全身性炎症反应综合征在肺部的表现。奥曲肽是人工合成的生长抑素的八肽衍生物，具有广泛的抗炎抗增殖活性，通过竞争性结合细胞表面的生长抑素受体，介导胞内一系列信号通路，调节多种生长激素分泌。生长激素在生长发育、维持细胞形态、新陈代谢等方面发挥着重要作用。代谢组学是用以定量描述生物体内内源性代谢物的整体及其动态变化规律的学科[5-6]。其研究的是生物体系受到刺激产生的内源性代谢变化，可以对那些能描述代谢循环情况的关键化合物进行定性和定量分析。它的主要研究目标是了解一个生物复杂系统中所有组成成分的构成及在特定条件下这些组分之间的相互关系。目前最常用的分离分析手段包括气相色谱和质谱联用、液相色谱和质谱联用及核磁共振技术。

本项目利用LC/MS、GC/MS技术进行分析发现奥曲肽处理LPS诱导的A549细胞后差异性代谢产物包括氨基酸、磷脂、核酸、有机酸等多种物质。通过搜索京都基因与基因组百科全书并下载相关产物的代谢通路数据，最终得到了代谢产物通路归属的互作图(图5)，揭示了奥曲肽处理LPS致A549细胞炎症反应过程中起主要作用的代谢路径，包括糖酵解/糖异生、色氨酸代谢、尿液循环和三羧酸循环。同时从该网络图中进一步筛选出具有标志性代谢物作用的14个关键成分，包括5-羟色胺、吲哚、苏氨酸、丝氨酸、葡萄糖、苯丙氨酸、乳糖、延胡索酸盐、4-羟基苯乳酸、冬氨酸盐、天门冬素、腐胺、脯氨酸和琥珀酸盐，确认它们在LPS致A549细胞炎症反应和奥曲肽的干预过程中均发挥重要作用，也具有较高的诊断准确性和应用前景。三羧酸循环通常是能量代谢的主体途径，炎症反应时糖酵解代之成为主要的能量代谢路径，具体表现为大量弱酸的产生和积累，该现象即为瓦博格效应。色氨酸代谢发生于包括抗>原呈递细胞在内各种免疫细胞中，如胎盘滋养层、巨噬细胞和树突细胞等。IL-α、IL-β和TNF-α等炎症因子从活化的炎症细胞中释放后诱导吲哚胺2,3-双加氧酶表达，从而促进色氨酸降解[7-8]。半乳糖代谢与感染性炎症密切相关，可保护小鼠豁免施瓦茨曼反应，也参与牙龈卟啉脂多糖引起的牙周韧带免疫反应和肺孢子菌所致的实验性肺炎[9-10]。此外，内源性毒性物质导致的炎症反应或造成组织损伤后炎症发生的多种过程中，均可能伴随尿素、尿酸等尿液循环的作用。就差异性的代谢分子而言，5-羟色胺是一种重要的炎症性因子，特别是在组织损伤的炎症反应中具有关键作用[11]。这提示本研究中的奥曲肽可能也是通过调控5-羟色胺水平来影响急性肺损伤的炎症反应。另外，腐胺也被认为在炎症反应发挥重要作用，有报告指出外源性腐胺可引起机体炎症反应，导致实验兔外周血中TNF-α、IL-1和IL-6等炎症因子的含量显著增加[12]。周恩臣等[13]研究发现，高密度脂蛋白通过甘油脂质代谢和胆碱代谢等5条代谢通路调控内皮细胞的代谢。而其它的氨基酸、糖和乳酸类作为生命的基础能源物质，可能与组织损伤的状态和过程密切相关，进而影响机体炎症水平。对这14个关键成分的进一步鉴别及具体作用过程仍需研究。

Figure 5.Metabolites network diagram. The red represents differences matter and the yellow is the corresponding channel.

图5 代谢物网络图

[1] 何 茹, 王瑜清. 奥曲肽在急性胰腺炎抗炎及免疫调节中的作用[J]. 西北国防医学杂志, 2014, 35(1): 3-6.

[2] 徐广华, 韩子华. 奥曲肽对粘连性肠梗阻患者血浆炎症因子的影响及疗效观察[J]. 药物流行病学杂志, 2013, 22(7): 353-355.

[3] 赖运兴, 张 浩, 鲍仲涛, 等. 奥曲肽联合灯盏花素减轻急性胰腺炎相关性肺损伤的研究[J]. 黑龙江医学, 2014, 38(4): 361-364.

[4] 刘元山, 陈剑群, 朱炳喜. 生长抑素对溃疡性结肠炎模型大鼠肠道炎性损伤的治疗作用[J]. 世界华人消化杂志, 2009, 17(17): 1726-1731.

[5] Nicholson JK, Connelly J, Lindon JC, et al. Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function[J]. Nat Rev Drug Discov, 2002, 12(2): 153-161.

[6] 张 栩，杨 楠，李丽娟，等.基于液质联用系统的小鼠心血管疾病模型花生四烯酸代谢组学研究方法[J].中国病理生理杂志，2012，28(11)：2095.

[7] Schröcksnadel K, Wirleitner B, Winkler C, et al. Monitoring tryptophan metabolism in chronic immune activation[J]. Clin Chim Acta, 2006, 364(1-2): 82-90.

[8] Scott GN, DuHadaway J, Pigott E, et al. The immunoregulatory enzyme IDO paradoxically drives B cell-mediated autoimmunity[J]. Immunol, 2009, 182(12): 7509-7517.

[9] Kasamatsu A, Uzawa K, Shimada K, et al. Elevation of galectin-9 as an inflammatory response in the periodontal ligament cells exposed to Porphylomonas gingivalis lipopolysaccharideinvitroandinvivo[J]. Biochem Cell Biol, 2005, 37(2): 397-408.

[10]Arikawa T, Saita N, Oomizu S, et al. Galectin-9 expands immunosuppressive macrophages to ameliorate T-cell-mediated lung inflammation[J]. Immunol, 2010, 40(2): 548-558.

[11]Tokunaga A, Saika M, Senba E. 5-HT2A receptor subtype is involved in the thermal hyperalgesic mechanism of serotonin in the periphery[J]. Pain, 1998, 76(3): 349-355.

[12]樊桂成，荣新洲，王学敏，等. 外源性腐胺和尸胺对兔外周血炎症因子的影响[J]. 中华烧伤杂志, 2012, 28(6): 451-454.

[13]周恩臣，黄子成，潘 兵，等. 2 型糖尿病高密度脂蛋白影响血管内皮细胞代谢网络的分子机制研究[J]. 中国病理生理杂志，2015, 28(10)：1828.

(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Effect of somatostatin analogue octreotide on metabolism of LPS-induced A549 cells

RUAN Luo-yang1,2, XU Xiao-hong2, PAN Feng-juan2, ZHONG Cui-ming2, TIAN Xiao-hua2, YANG Cai-lan2, LI Ya-lan1

(1TheFirstClinicalCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;2TheHospitalofGuangdongAgriculturalReclamation,Zhanjiang524002,China.E-mail:tyalan@jnu.edu.com)

AIM: To investigate the effects of octreotide on metabolism in the A549 cells treated with lipopolysaccharides (LPS). METHODS: The technologies of gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) and liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) were used to test the metabolism of lung A549 cells subject to different treatment with LPS and/or octreotide. The results were visualized and checked by chromatogram, and the corresponding intensity data were analyzed by the principal component analysis(PCA)method. The metabolites with different expression and the underlying interaction network were resolved. RESULTS: The metabolism analysis by LC/MS method indicated that there were different expression levels between different treated groups. Further analysis was carried out by orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis (OPLS-DA) and the different expressed metabolites were obtained, which were mainly amino acids and phospholipids. By analyzing with GC/MS method andt-test, the different expressed metabolites were mainly organic acid, saccharides and amino acid metabolite. The interaction network diagram was constructed about the response of A549 cells induced by LPS and/or octreotide, including glycolysis/gluconenogenesis, tryptophan metabolism, galactose metabolism, urine cycle and citrate cycle. Fourteen key components were found such as serotonin, indole, threonine, serine, glucose, phenylalanine, lactose, fumarate, 4-hydroxyphenyllactate, aspartate, asparagine, putrescine, proline and succinate. CONCLUSION: In octreotide treated LPS-induced A549 cells, the main metabolites are organic acid, saccharides, amino acids and phospholipids. The interaction network is constructed, including 5 metabolic pathways and 14 key components.

A549 cells; Octreotide; Lipopolysaccharides; Metabolism

1000- 4718(2016)09- 1694- 06

2016- 02- 29

2016- 07- 06

湛江市财政资金科技专项竞争性分配项目(No. 2013A01023)

△通讯作者 Tel: 18928903868; E-mail: tyalan@jnu.edu.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.027

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