自拟补肾活血颗粒对去卵巢骨质疏松症大鼠的治疗作用*

惠红岩， 董玉珍

(新乡医学院第一附属医院 1临床药学办公室， 2骨科， 河南 卫辉 453100)



自拟补肾活血颗粒对去卵巢骨质疏松症大鼠的治疗作用*

惠红岩1△， 董玉珍2

(新乡医学院第一附属医院1临床药学办公室，2骨科， 河南 卫辉 453100)

目的： 观察自拟补肾活血颗粒(MBHG)对去卵巢大鼠骨质疏松症的治疗作用。方法：雌性SD大鼠，随机取10只作为假手术组(sham组)，其余大鼠制备去卵巢骨质疏松症，随机分为：模型(model)组；补肾活血颗粒高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)剂量组；阳性对照组(戊酸雌二醇组)。每组10只，连续灌胃给药12周。观察大鼠骨小梁形态，测量骨小梁的面积、厚度、间距及面积百分数，全自动分析仪检测血清中钙、磷和碱性磷酸酶(ALP)含量，测量大鼠骨密度(BMD)，ELISA法检测血清雌激素(E2)、骨钙素(BGP)、骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化因子(RANK)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)水平。结果：与模型组比较，各给药组骨小梁显著变宽，数目增多，网状结构有部分恢复。各给药组骨小梁厚度、骨小梁面积和骨小梁面积百分数均大于模型组，骨小梁间距均小于模型组(P<0.05)。各给药组血清中钙、磷、E2、OPG以及股骨BMD水平均显著高于模型组，ALP、BGP、RANK和RANKL水平均显著低于模型组(P<0.01)。结论：自拟补肾活血颗粒对去卵巢大鼠骨质疏松症有显著的治疗作用。作用机制可能与上调OPG、抑制RANKL分泌有关。

自拟补肾活血颗粒； 去卵巢后骨质疏松症； 骨保护素； 核因子κB受体活化因子配体

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种全身代谢性骨病，患者多呈现骨量减少、骨组织微结构异常、骨骼易碎易骨折等特点[1]。目前，OP多发于妇女及老年人，全世界患者数量已达2亿之多，发病率已跃居常见及多发病的第7位，且中国7%的人口患有OP，并且有逐年增长的趋势。预计到2050年，OP患者将达到总人口的13.2%[2-5]。OP可分为原发性和继发性两大类，因雌激素严重缺乏而致的绝经后骨质疏松症占有很大比例，以补充雌激素和孕激素为主的治疗方法副作用较大，易引起子宫内膜癌和乳腺癌的发生[6]。OP在中医学上被认为属于“骨痹”或“骨萎”，多以气血阻滞，肾精亏虚病机为主，前人研究已经证实，补肾活血颗粒以中医病机为基础，治疗OP疗效显著，其机制与其影响骨保护素(osteoprotegerin，OPG)/核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL) mRNA及蛋白水平、上调OPG/RANKL的表达有关[7]。本实验所用自拟方补肾活血颗粒(modified Bushen Huoxue granules，MBHG)在原方的基础上加入菟丝子、续断和肉苁蓉，补益肝肾，强筋骨，大大增强了补肾作用。本文拟观察自拟补肾活血颗粒对去卵巢大鼠骨质疏松症的治疗作用，为其进一步的临床应用提供理论基础。

材 料 和 方 法

1 动物

SD大鼠，SPF 级，雌性，3月龄，体重260～280 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号为SCXK京2009-0004。

2 主要试剂和仪器

戊酸雌二醇片购于DELPHARM Lille S.A.S，配成0.02 g/L水溶液；自拟补肾活血颗粒由熟地、肉桂、杜仲、山药、附子、枸杞、菟丝子、续断、肉苁蓉、甘草、红花和山茱萸组成；血清雌二醇(estradiol，E2)、骨钙素(bone Gla protein，BGP)、OPG、核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)和RANKL ELISA试剂盒均购自上海索宝生物科技有限公司。

ExcelsiorTMES型自动组织脱水机(Thermo);TK-218型恒温摊片烤片机(湖北泰维医疗科技有限责任公司)；RM2125型常规轮转石蜡切片机(Leica)；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；BH-2型显微镜及摄像装置、BX50荧光显微镜(OLYMPUS)；DP70彩色数码成像系统(北京华跃英泰科技有限公司)；全自动生化分析仪(Beckman)；Multiskan MK3酶标仪(Thermo)；GE Lunar Prodigy 双能X线骨密度仪(上海同舸医疗器械有限公司)。

3 主要方法

3.1 大鼠模型制备及分组 70只雌性SD大鼠，3月龄，适应性喂养7 d后，随机选取10只作为假手术(sham)组，其余大鼠作为造模组。参照吴彬等[8-9]文献，模型制备方法如下：4%水合氯醛麻醉，皮肤经酒精消毒后，沿正中线剪开1.5～2.0 cm的缺口，切除肾脏后方多余脂肪，将卵巢轻轻提出，同时结扎卵巢双侧输卵管及血管，切除卵巢；假手术组保留卵巢，但同时切除卵巢旁多余脂肪。8周后，造模组死亡4只，将剩余56只大鼠依据简单随机抽样法选取6只造模组大鼠处死后进行骨密度(bone mineral density，BMD)及E2水平(ELISA法)测定，验证模型制备成功。将成功造模大鼠完全随机分为：模型(model)组；补肾活血颗粒高剂量(MBHG-high dose,MBHG-H;200 mg/kg)、中剂量(MBHG-middle dose,MBHG-M;100 mg/kg)、低剂量(MBHG-low dose,MBHG-L;50 mg/kg)组;阳性对照戊酸雌二醇组，每组10只。MBHG各剂量组及阳性对照组按上述剂量连续灌胃(ig)，每天1次，灌胃体积10 mL/kg；假手术组及模型组ig等体积蒸馏水，连续12周。

3.2 大鼠骨小梁形态观察 给药结束，4%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，迅速分离右侧股骨，以至将肌肉和筋膜等软组织全部剔除，4%甲醛溶液固定48 h。将已固定好的股骨置于脱钙液中(每周更换1次)，每天检查脱钙情况，至大头针能刺透为止，脱钙结束。取脱钙完成的右侧胫骨，常规脱水、石蜡包埋、常规 5 μm 组织切片，HE法染色，显微镜下观察骨组织结构变化。

3.3 骨小梁形态计量学指标观察 显微镜下观察并采集HE染色图像，每张片取10个视野，观察同一个位点，测量骨小梁的面积、厚度、间距及面积百分数[10]。

3.4 血清中钙(calcium，Ca)、磷(phosphorus，P)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量的检测 大鼠经4%水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血，4 ℃静置30 min，3 000 r/min离心10 min，取血清分装到EP管中，于-80 ℃冰箱保存待测。全自动生化仪测定血清中Ca、P和ALP含量。

3.5 ELISA法检测血清E2、BGP、OPG、RANK和RANKL的水平 将ELISA试剂盒从4 ℃冰箱中取出，室温下平衡30 min。待上述备用血清冰上解冻后按试剂盒说明书检测血清中E2、BGP、OPG、RANK和RANKL的水平。

3.6 大鼠BMD的测定 给药8周后，大鼠经4%水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血，取右侧股骨用Lunar Prodigy双能X射线骨密度测量仪检测股骨干骺端BMD。

4 统计学处理

计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0 统计软件分析，各组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HE法观察大鼠骨小梁形态变化

Sham组胫骨HE染色后镜下可见骨细胞染色均匀明显，骨小梁宽而粗，粗壮、饱满，壁厚，形态结构完整，排布规则有序，呈网状结构分布，密度面积正常，骨小梁间隙较小。与sham组比较，model组大鼠的胫骨骨小梁稀疏、变细、变薄，扭曲，断裂，网状结构被破坏，骨髓腔变宽或不规则。与model组比较，MBHG-H、MBHG-M、MBHG-L组及戊酸雌二醇阳性对照组的骨小梁显著变宽，数目增多，网状结构有部分恢复，排列尚整齐连接成网，部分间隙略增大，见图1。

Figure 1.The morphology of trabecular bone in the rats with different treatments (×400). A: sham group; B: model group; C: MBHG-H group; D: MBHG-M group; E: MBHG-L group; F: estradiol valerate group.

图1 大鼠骨小梁组织形态变化

2 骨小梁形态计量学指标观察

Model组的骨小梁厚度、骨小梁面积及骨小梁面积百分数均显著小于sham组，骨小梁间距显著大于sham组(P<0.01)；MBHG-H、MBHG-M、MBHG-L组和戊酸雌二醇阳性对照组的骨小梁厚度、骨小梁面积和骨小梁面积百分数均大于model组，骨小梁间距均小于model组(P<0.05),见表1。

表1 MBHG对大鼠股骨骨小梁参数的影响

*P<0.05,**P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group.

3 血清中Ca、P和ALP含量的检测

Model组血清中Ca和P水平均显著低于sham组，ALP含量显著高于sham组(P<0.01)，差异有统计学显著性。MBHG-H、MBHG-M、MBHG-L组和戊酸雌二醇阳性对照组血清中的Ca和P水平均显著高于sham组，ALP含量显著低于sham组(P<0.01)，见表2。

4 血清E2、BGP水平以及股骨BMD的测定

Model组血清中E2和股骨BMD水平显著低于sham组，血清BGP含量显著高于sham组(P<0.01)。MBHG-H、MBHG-M、MBHG-L和戊酸雌二醇阳性对照组血清中E2和股骨BMD水平均显著高于sham组，血清BGP含量显著低于sham组(P<0.01)，见表3。

5 ELISA法检测血清OPG、RANK和RANKL水平

Model组大鼠的血清OPG水平显著低于sham组(P<0.01)，RANK和RANKL水平显著高于sham组(P<0.01)。MBHG-H、MBHG-M、MBHG-L和戊酸雌二醇阳性对照组大鼠的血清OPG水平显著高于sham组(P<0.01)，RANK和RANKL水平显著低于sham组(P<0.01),见表4。

表2 MBHG对大鼠血清Ca、P和ALP的影响

*P<0.05,**P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group.

表3 MBHG对大鼠血清E2、BGP水平和BMD的影响

**P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group.

*P<0.05,**P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group.

讨 论

现代研究证实，原发性骨质疏松症以肾虚为主，同时伴有血瘀，肾虚日久必有血瘀，血瘀则化精乏源，可加重肾虚。前期研究发现，补肾活血颗粒[11]由熟地、肉桂、杜仲、山药、附子、枸杞、甘草、红花和山茱萸组成，具有补肾壮阳、调气活血之功效，治疗去卵巢骨质疏松模型大鼠，疗效显著。本方在前人的补肾活血颗粒的基础上加以改良，加入菟丝子、续断和肉苁蓉，增强补益肝肾的作用，疗效更加显著。方中熟地和杜仲具有养血滋阴、补精益髓之功效；肉桂和附子散寒止痛，温通经脉；山药、甘草、红花和山茱萸补肾活血，补脾益气，强筋健骨，活血通络，共同治疗肾虚血瘀之症。

妇女绝经后，雌激素缺乏，骨转化率高，破骨细胞的吸收远远大于成骨细胞的形成，导致净骨量的丢失[1]。骨代谢生化指标的检测简单方便、快捷，可准确灵敏地反映骨代谢转换情况，联合BMD预测骨质疏松发生程度，药效评价较高。Ca和P是骨矿化的必需元素，以其为主要成分的骨矿化物质在骨骼中沉积代表着骨骼的坚实程度。另外，磷酸酶合成于骨基质成熟阶段，血清中50%来源于骨的ALP是新生骨分泌的产物，能够较好反映出成骨细胞的活性和状态，反映早期骨质疏松骨代谢的变化，同时，ALP对骨的矿化形成有重要的保护作用，可以反应成骨细胞的活性，已经作为临床上诊断骨质疏松的参考依据。ALP与BGP均是反映成骨细胞活性的重要指标，有结果显示，绝经后，骨转化率升高，两者含量随之升高，因此测量血清中E2、Ca、P、ALP和BGP对于评价骨质疏松症有着重要的意义[12-13]。

本实验研究发现，模型组血清中Ca和P水平均显著低于假手术组，ALP含量显著高于假手术组；自拟补肾活血颗粒治疗组和阳性对照组血清中Ca和P水平均显著高于假手术组，ALP含量显著低于假手术组。结合股骨骨小梁形态变化及骨小梁各参数结果显示，假手术组胫骨HE染色后镜下可见，骨细胞染色均匀明显，骨小梁宽而粗，粗壮、饱满，壁厚，形态结构完整，排布规则有序，呈网状结构分布，密度面积正常，骨小梁间隙较小。与假手术组比较，模型组大鼠胫骨骨小梁稀疏、变细、变薄，扭曲，断裂，网状结构被破坏，骨髓腔变宽或不规则，骨小梁厚度、骨小梁面积及骨小梁面积百分数均显著小于假手术组，骨小梁间距显著大于假手术组。与模型组比较，自拟补肾活血颗粒高、中、低剂量组及戊酸雌二醇阳性对照组，骨小梁显著变宽，数目增多，网状结构有部分恢复，排列尚整齐连接成网，部分间隙略增大，骨小梁厚度、骨小梁面积、骨小梁面积百分数均大于模型组，骨小梁间距均小于模型组。HE染色明显加之BMD、E2、Ca和P显著下降，ALP和BGP显著升高，推知去卵巢后骨的重建和吸收无法达到协调，骨吸收大大增加，骨质疏松严重。而自拟补肾活血颗粒各剂量组及戊酸雌二醇阳性对照组可有效改善雌激素下降，骨小梁组织形态改变等，有利于Ca和P水平的增加，ALP和BGP水平的降低，对OP有很好的治疗作用。

最近研究证实[7]，雌激素减少可引起破骨细胞分化因子RANKL和成骨细胞骨素OPG的分泌失衡，OPG/RANKL系统被认为是雌激素对骨骼产生作用的中间环节，若此系统平衡受限，导致骨转换增加，导致OP的发生。OPG由OB细胞分泌，而RANKL可促进OC分化，OPG可通过竞争性地与RANKL相结合，阻断RANKL与RANK结合，抑制OC活化，降低骨吸收活性，促进骨的重建。本实验结果显示，模型组大鼠血清OPG水平显著低于假手术组，RANK和RANKL水平显著高于假手术组。自拟补肾活血颗粒治疗组和阳性对照组大鼠血清OPG水平显著高于假手术组和RANK和RANKL水平显著低于假手术组。推测自拟补肾活血颗粒各剂量组可通过有效平衡OPG/RANKL比例，降低骨吸收，提高骨对的重建率，有效缓解OP。综上所述，自拟补肾活血颗粒对OP有较好的治疗作用，其机制与调整OPG/RANKL的比例有关。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

AIM: To observe the therapeutic effect of modified Bushen Huoxue granules (MBHG) on ovariectomized osteoporosis rats. METHODS: Female SD rats were randomly given sham operation (n=10) and ovariectomy, and then the model rats were further randomly divided into model group, MBHG treatment groups at doses of 200 mg/kg, 100 mg/kg and 50 mg/kg respectively, and positive control (estradiol valerate) group, with 10 rats in each group by intragastric administration for 12 weeks. The morphology, area, thickness, spacing and area percentage of trabecular bone in the rats were observed. The serum levels of calcium (Ca), phosphorus (P) and alkaline phosphatase (ALP) were mea-sured by automatic analyzer. Bone mineral density (BMD) was analyzed. Serum estradiol (E2), osteocalcin (BGP)， osteoprotegerin (OPG), receptor activator of nuclear factor-κB (RANK) and receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL) levels were detected by ELISA. RESULTS: Compared with model group, trabecular bone significantly widened in all treatment groups with large number, and net-like structure restored partially. The thickness, area and area percentages of trabecular bone in treatments groups were higher than those in model group,and trabecular spacing was less than that in model group (P<0.05). The serum Ca, P, E2and OPG, and femoral BMD were significantly higher in treatment groups than those in model group, and the levels of ALP, BGP, RANK and RANKL were significantly lower than those in model group (P<0.01). CONCLUSION: MBHG has a significant therapeutic effect on ovariectomized osteoporosis rats. The mechanism may be related to the regulation of OPG and inhibition of RANKL secretion.

Modified Bushen Huoxue granules; Ovariectomized osteoporosis; Osteoprotegerin; Receptor activator of nuclear factor κB ligand

杂志网址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1683- 05

2016- 03- 28

2016- 06- 16

河南省医学科技攻关计划项目(No. 201403141)

△ 通讯作者 Tel: 0373-4404491； E-mail: xiang8zi@163.com

R285.5； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.025

Therapeutic effects of modified Bushen Huoxue granules on ovariectomized osteoporosis ratsHUI Hong-yan1, DONG Yu-zhen2

(1DepartmentofPharmacy,ClinicalPharmacist，2DepartmentofOrthopedics,TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Weihui453100,China.E-mail:xiang8zi@163.com)