SOX5基因多态性与慢性阻塞性肺疾病及并发症肺动脉高压的关联性分析*

耑 冰， 何 凌， 鲁玉婷， 李 萍， 赵 霞， 邱国辉， 马 南， 马 威， 杨 朝△

(1西北民族大学第一附属医院呼吸内科， 2宁夏人民医院呼吸内科，宁夏 银川 750001；3漯河市第一人民医院呼吸科， 4漯河市中医院内二科，河南 漯河 462000；5宁夏医科大学，宁夏 银川750021； 6西北民族大学第一临床学院，宁夏 银川 750001)



SOX5基因多态性与慢性阻塞性肺疾病及并发症肺动脉高压的关联性分析*

耑 冰1, 2， 何 凌3， 鲁玉婷4， 李 萍1, 2， 赵 霞1, 2， 邱国辉5， 马 南5， 马 威6， 杨 朝1, 2△

(1西北民族大学第一附属医院呼吸内科，2宁夏人民医院呼吸内科，宁夏 银川 750001；3漯河市第一人民医院呼吸科，4漯河市中医院内二科，河南 漯河 462000；5宁夏医科大学，宁夏 银川750021；6西北民族大学第一临床学院，宁夏 银川 750001)

目的： 通过观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)稳定期患者、COPD合并肺动脉高压(PH)患者及健康者之间SOX5基因单核苷酸多态性(SNPs)的分布差异，初步探索SOX5基因多态性与COPD相关PH易感性的关联。方法: 连续选择2013年4月～2015年4月就诊于宁夏人民医院总院及宁南分院呼吸内科的COPD稳定期患者250例，根据COPD诊治指南(2013年版)诊断标准入组，并且就诊当天全部进行超声心动图检查，根据肺动脉收缩压(PASP)结果分为COPD合并PH组(PASP≥50 mmHg)103例和COPD非PH组(PASP<50 mmHg)147例。健康对照组选择同期在宁夏人民医院体检的健康者127例。使用Sequenom MassARRAY SNP检测系统检测所有受试者SOX5基因rs10842262和rs11046966位点的基因型，统计基因型频率并对比各组间差异。结果: 健康对照组与COPD组之间(包括COPD合并PH及未合并PH组的全部患者)以及COPD合并PH组与COPD非PH组之间在年龄、性别和吸烟指数上的差别均无统计学显著性。健康对照组与COPD组之间SOX5基因rs10842262位点及rs11046966位点基因型频率分布的差异均存在统计学显著性(P<0.05)。COPD合并PH组与COPD非PH组之间SOX5基因rs10842262位点及rs11046966位点各基因型频率分布的差异无统计学显著性。结论:SOX5基因rs10842262和rs11046966位点的基因多态性与COPD的易感性相关，但与COPD相关PH的易感性还不能认为有关联。

慢性阻塞性肺疾病； 肺动脉高压；SOX5基因； 单核苷酸多态性

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一种以持续气流受限为特征，严重危害人类健康的常见病、多发病。随着病程的进展，COPD会出现多种并发症，其中较常见的是肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)。PH是COPD发展至肺心病的关键过程[1]，可使肺循环阻力逐渐增大，引起右心室的肥大及右心功能衰竭，最终导致患者的死亡。

越来越多的研究发现，基因多态性，尤其是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，可通过影响炎症、免疫、蛋白酶-抗蛋白酶平衡、氧化-抗氧化平衡、肺发育-修复平衡等途径参与COPD的发病过程[2]。一项以家系为基础的关于早发COPD的研究发现[3]，染色体12p区域基因可能与FEV1的下降以及中度气流阻塞存在一定关联。另一项全基因组相关研究(genome-wide association study，GWAS)进一步锁定了12p区域的SOX5基因rs11046966位点或许与COPD的致病风险相关[4]。同时，SOX5的另一关键位点rs10842262目前在非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia，NOA)中被广泛研究[5]，但该位点在中国人群COPD的致病风险中研究较少。迄今为止，SOX5基因rs10842262位点及rs11046966位点在COPD相关PH发病易感性上是否存在联系目前尚不明确。

因此，本研究拟对比COPD合并PH的患者、COPD非PH的患者以及健康者之间SOX5基因rs10842262位点和rs11046966位点基因型频率的分布差异，初步探索SOX5基因的SNPs在部分中国人群COPD相关PH的易感性上是否存在联系，进而为COPD相关PH的易感基因筛查提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 研究对象

病例组为连续选择2013年4月～2015年4月就诊于宁夏人民医院总院及宁夏人民医院宁南分院呼吸内科的COPD患者250例，平均年龄(72.1±10.2)岁(男女比例143/107)。健康对照组选择同期于宁夏人民医院体检中心进行体检的健康体检者127例，平均年龄(71.2±9.5)岁(男女比例为66/61)。为了避免收入潜在的COPD患者，由呼吸内科专科医师询问病史、查体并核查体检报告中胸片、心脏彩超、肺功能检查结果均无异常。

COPD纳入标准：所有入组的COPD患者均按照2013年《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》中推荐COPD诊断标准中相应临床表现、危险因素、体征，且第1秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)<70%[6]。PH的诊断根据2009年欧洲呼吸学会和欧洲心脏病学会联合颁布的PH诊治指南[7]中提及超声心动图诊断PH的标准；根据病史，临床表现可疑者，超声心动图检查三尖瓣返流速度>3.4 m/s，肺动脉收缩压(pulmonary artery systolic pressure，PASP)≥50 mmHg。我们按照以上标准将COPD患者按照心脏彩超检查PASP结果分为 COPD-PH组[PASP≥50 mmHg,103例，平均年龄(73.2±9.3)岁,男女比例为58/45]； COPD非PH组[PASP<50 mmHg，147例，平均年龄(71.3±10.7)岁，男女比例为85/62]。

排除：肺结核、阻塞性睡眠暂停低通气综合征、慢性哮喘、肺栓塞，以及间质性肺病、胸廓畸形等限制性通气障碍；高血压、先天性心脏病、心瓣膜病、冠状动脉粥样硬化性心脏病，以及左心功能不全严重充血性心衰(2～4级NYHA分级)；恶性肿瘤疾病；自身免疫性疾病；糖尿病、严重的内分泌疾病、贫血等血液疾病、严重的肝、肾功能损伤等；静脉药物滥用、抑制食欲药物(如右芬氟拉明、阿米雷司及其衍生物等)以除外药物引起的PH。

本研究为回顾性病例对照研究，所有入组者均遵循自愿参加原则，签署知情同意书，并经过宁夏自治区人民医院伦理委员会批准。

2 研究方法

2.1 DNA的提取 所有受试者禁食后晨起抽取外周静脉血4 mL用于本研究，使用AxyPrep 血基因组DNA小量试剂盒(AXYGEN)提取DNA。

2.2SOX5基因SNP位点基因分型 将DNA样本稀释至50 μg/L，并委托北京博奥生物有限公司采用Sequenom MassARRAY平台(Sequenom)进行SNP的分型，引物设计使用Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，并交由北京博奥生物公司合成。rs11046966位点的上游引物为5′-ACGTTGGATGACCCAGAATTTGCTTATGCC-3′，下游引物为5′- ACGTTGGATGAACCACAGTTCCAGATAAGC-3′，延伸引物为5′-CGTTACAGATAAGCAAGAATCCATCC-3′； rs10842262位点的上游引物为 5′-ACGTTGGATGTCCTGATTCGAATCCTATG-3′，下游引物为5′-ACGTTGGATGTATGGGTTAACACAGAGTGC-3′，延伸引物为 5′-ATTCGAATCCTATGTACACTA-3′。

2.3 测序的质量控制 使用5管已经使用二代测序验证(南京金斯瑞生物科技有限公司)的DNA作为阳性对照，使用5管鲑鱼精DNA作为阴性对照，混杂在待测的所有DNA样本中进行SNP分型，最后结果完全匹配。

3 统计学处理

数据的统计与处理采用SPSS17.0统计软件，以P<0.05为差异有统计学显著性。年龄、吸烟指数等计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间均数的对比使用独立样本t检验，多组间均数的对比采用单因素方差分析；两组间性别构成比、基因型频率的对比采用卡方检验，使用Hardy-Weinberg 平衡法检验各组受试人员基因型频率， 以P>0.05为该群体的基因型符合遗传学平衡标准，即代表样本具有群体遗传代表性。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 一般资料

分别对比COPD组(包括COPD非PH组与COPD合并PH组所有患者)与健康对照组之间、COPD非PH组与COPD合并PH组之间的年龄、性别构成及吸烟指数(吸烟指数单位定义为每天吸烟1包持续吸烟1年)等指标，结果显示：COPD组与健康对照组在年龄、性别构成比和吸烟指数上的差别均无统计学显著性，提示两组之间具有可比性,见表1。COPD非PH组与COPD合并PH组在年龄、性别构成比和吸烟指数上的差别也均无统计学显著性，提示两组之间具有可比性,见表2。

2 Hardy-Weinberg基因遗传平衡性检验

经过Hardy-Weinberg 平衡检验，健康对照组、COPD组(包括COPD非PH组与COPD合并PH组所有患者)、COPD非PH组以及COPD合并PH组4组均具有群体遗传代表性,见表3。

表1 健康对照组与COPD组间一般资料比较

表2 COPD-非PH组与COPD-PH组间一般资料比较

表3 SOX5基因rs11046966和rs10842262位点基因型在各组间的Hardy-Weinberg 平衡检验

P>0.05 suggests that the distribution ofSOX5 genotypes in the studied groups was representative of the genotype distribution in the entire population.

3 rs11046966和rs10842262位点基因型频率与COPD的关联性分析

SOX5基因rs11046966位点的基因型频率在健康对照组和COPD组间的分布差别存在统计学显著性(P<0.05)。同时SOX5基因rs10842262位点基因型频率在COPD患者及健康对照者之间分布的差别也有统计学显著性(P<0.05),见表4。

4 rs11046966和rs10842262位点基因型频率在COPD合并PH的关联性分析

SOX5基因rs11046966和rs10842262位点基因型频率在COPD非PH组与COPD合并PH组之间的差别无统计学显著性,见表5。

表4 健康对照组与COPD组之间rs11046966和rs10842262位点基因型频率的对比

表5 COPD非PH组与COPD合并PH组间rs11046966和rs10842262位点基因型频率对比

讨 论

COPD的发病机制较为复杂，且个体之间发病易感性差异较大。究其原因，目前认为除了烟雾、缺氧等环境因素之外，基因多态性也起着一定作用[8]，针对基因多态性研究中最多的就是SNPs。SNPs是指某一基因中人群发生率超过1%的单个碱基的替换或颠换现象，发生在基因编码区的SNPs 会导致其表达产物蛋白质中氨基酸替换，并对蛋白质的活性和生物学效应发生重要影响，在人体对致病物质的敏感性与耐受性、对药物治疗的反应性以及对疾病的易感性上都起着重要的作用。

SOX5基因是SOX基因家族中的重要成员之一，该基因家族成员表达产物的共同特点是均含高度保守的HMG box DNA结合域，SOX基因表达产物通过该结构域与对应DNA片段特异性结合，从而可以在个体各种发育过程中对特定细胞进行调控，决定细胞命运，已经证实其在肺组织中广泛表达[9]。目前，SOX5基因的SNPs在神经胶质瘤、乳腺癌及NOA等疾病中被广泛研究[10-12]。

近期有研究发现SOX5基因的SNPs与COPD的发病有一定关联[3]。有学者通过全基因组关联研究，发现SOX5基因3’端的rs11046966位点SNPs可能与COPD的发生具有显著关联，考虑SOX5基因是COPD的一个易感基因；并进一步通过对比SOX5基因敲除小鼠SOX5(-/-)、SOX5杂合基因小鼠SOX5(+/-)以及野生小鼠SOX5(+/+)肺发育情况，初步发现SOX5表达产物对于肺组织发育有一定作用，认为SOX5可能是通过影响肺发育来影响COPD发病进程。虽然这些肺发育的变化可能不会直接在儿童时期就显现出来，但是可以增加机体对损伤因素的敏感性(比如说烟雾)[13-14]。

本研究采用病例对照研究的方法，通过飞行质谱法检测中国宁夏回族自治区人群250例COPD患者及127例健康对照者SOX5基因SNPs位点基因型，发现SOX5的基因rs11046966位点的基因型频率在两组间的分布差别存在统计学显著性，提示SOX5的基因rs11046966位点与COPD致病易感性有一定关联。本研究同时发现SOX5基因rs10842262位点基因型频率在COPD患者及健康对照者之间分布的差别有统计学显著性，基因型频率提示rs10842262位点与COPD易感性有关联。然而，目前rs10842262位点在COPD易感性中研究较少，一项关于非梗阻性无精子症的研究[15]指出，该位点所在的SOX5基因通过诱导精子细胞尾部变形在精子发育中起关键作用，进一步研究发现[16]，SOX5基因在一些包含纤毛的组织(如睾丸、肺、脑等)内高度表达，在纤毛的形成和运动中发挥重要作用。因此我们推测，rs10842262位点或许可能通过影响气道内皮纤毛的发育和功能进而影响COPD的发生和进展，这些推测仍需要下一步通过动物实验证实。

本研究将250例COPD患者分为COPD-非PH组与COPD合并PH组，检测rs11046966位点及rs10842262位点各自在两组间SNPs分布，发现两位点在两组之间的分布差别无统计学显著性，提示SOX5的基因rs11046966位点及rs10842262位点与COPD相关PH致病关联不大，因目前相似研究较少，我们考虑两组间差别无统计学显著性的原因如下：首先，PH是一种多因素参与的复杂的疾病，缺氧、离子通道功能紊乱，血管内皮细胞功能异常、血管舒缩因子合成分泌的失调等多种因素都在PH的发展中起作用，因SOX5基因rs11046966位点及rs10842262位点基因多态性所引起的SOX5表达水平的变化可能不足以对上述病理生理过程产生决定性影响。其次，样本量不够大也使本实验产生II型错误的可能性增加，使实验出现假阴性的结论。最后，超声心动图虽然可以达到一定的灵敏度和特异度，但毕竟不是诊断PH的金标准，可能使实验分组产生一定的偏倚。因此，下一步研究我们需要继续扩大样本量，在条件具备后使用右心导管法检测肺动脉压力，从而增加实验的说服力。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Association of SOX5 polymorphisms in chronic obstructive pulmonary disease-related pulmonary hypertension

ZHUAN Bing1, 2, HE Ling3, LU Yu-ting4, LI Ping1, 2, ZHAO Xia1, 2, QIU Guo-hui5, MA Nan5, MA Wei6, YANG Zhao1, 2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,FirstAffiliatedHospitalofNorthwestUniversityforNationalities，2DepartmentofRespiratoryMedicine,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750001,China;3DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstPeople’sHospitalofLuohe，4TheSecondDepartmentofInternalMedicine,TraditionalChineseMedicinalHospitalofLuohe,Luohe462000,China;5TheNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750021,China;6TheFirstClinicalCollegeofFirstAffiliatedHospitalofNorthwestUniversityforNationalities,Yinchuan750001,China.E-mail:greentree66611@sina.com)

AIM: To investigate the differences in the distribution of SRY-related HMG box 5 (SOX5) gene single nucleotide polymorphisms (SNPs) among stable chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patients, COPD with pulmonary hypertension (PH) patients and healthy controls, and to explore the association of theSOX5 SNPs in COPD-related PH. METHODS: From April 2013 to April 2015, 250 patients with stable COPD were enrolled continuously in Ningxia People’s Hospital according to COPD treatment guidelines (2013 edition). All the patients received echocardiography, and were divided into COPD with PH group [pulmonary artery systolic pressure (PASP)≥50 mmHg,n=103] and COPD without PH group (PASP<50 mmHg,n=147). The healthy persons (matched for age, sex, race and smoking index,n=127) were selected as control group at the same period. Genotyping ofSOX5 gene rs10842262 and rs11046966 loci was performed using MassARRAY genotyping system (Sequenom). Genotype frequencies were calculated. RESULTS: Age, sex and smoking index showed no significantly difference between control group and COPD group, neither between COPD with PH group and COPD without PH group. Genotype frequencies ofSOX5 gene rs10842262 and rs11046966 loci between control group and COPD group was of significant difference (P<0.05). Genotype frequencies ofSOX5 gene rs10842262 and rs11046966 loci showed no significant difference between COPD with PH group and COPD without PH group. CONCLUSION:SOX5 gene rs10842262 and rs11046966 loci may play an important role in COPD, but not in COPD-related PH.

Chronic obstructive pulmonary disease; Pulmonary hypertension;SOX5 gene; Single nucleotide polymorphisms

杂志网址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1648- 05

2016- 03- 21

2016- 05- 04

国家自然科学基金资助项目(No. 81160011； No. 81560014)； 西北民族大学中央高校基本科研业务费资助项目(No. 31920150056)

△通讯作者 Tel: 0951-5920282; E-mail: greentree66611@sina.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.019