氟西汀调控CUMS抑郁大鼠海马突触重塑*

沈忠飞， 王志坚， 潘巍巍， 郭燕君， 伏春艳， 袁凤凤

(嘉兴学院医学院， 浙江 嘉兴 314000)



氟西汀调控CUMS抑郁大鼠海马突触重塑*

沈忠飞△， 王志坚， 潘巍巍， 郭燕君， 伏春艳， 袁凤凤

(嘉兴学院医学院， 浙江 嘉兴 314000)

目的： 探究氟西汀(fluoxetine)对慢性不可预见性温和刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)抑郁大鼠海马突触重塑的mTOR和细胞自噬信号调控作用。方法: 60只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分成正常对照(control)组、CUMS组和氟西汀组。采用CUMS结合孤养法构建CUMS抑郁模型，期间给予氟西汀(20 mg·kg-1·d-1)灌胃治疗。通过体重变化、糖水测试水平及行为学实验验证模型建立，采用RT-PCR和Western blotting等生化方法测定突触重塑相关蛋白胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、突触泡蛋白(synaptophysin, SYP)，细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、cleaved caspase-3，mTOR信号通路相关蛋白mTOR、4EBP1，自噬相关蛋白beclin 1、LC3 mRNA及蛋白表达水平的变化。结果: 与control组相比，CUMS大鼠的体重、糖水摄取量、旷场实验总路程和中间停留时间均下降，差异具有统计学显著性。RT-PCR和Western blotting实验结果显示，与control组相比，CUMS组SYP和GFAP的mRNA和蛋白水平显著下调，Bcl-2表达下调， cleaved caspases-3上调，mTOR及下游靶分子4EBP1磷酸化水平下调，细胞自噬关键基因beclin1和LC3 在mRNA和蛋白水平显著上调。氟西汀可以减缓以上结果中的上调或下调趋势，差异具有统计学显著性。结论: 氟西汀可能通过下调细胞凋亡和自噬信号通路以及上调mTOR信号通路调节海马突触重塑并缓解抑郁症状。

氟西汀； 抑郁； 突触重塑； 细胞凋亡； mTOR信号通路； 自噬

抑郁症是以情绪低落、快感缺失、疲惫和认知功能下降为主要特征的一类精神疾病，患者还常常伴随失眠、肠胃紊乱和自责感，严重可产生自杀倾向[1]。据最新统计，中国每年有20万人死于抑郁症，世界卫生组织预测抑郁症在 2020 年左右将成为继高血压之后的第二大临床慢性疾病[2]。由于抑郁症常与酒精成瘾等其它生活恶习存在相关，或存在共病机制，复杂多样，目前发病机制并没有定论[3]。对抑郁症患者脑部进行核磁共振成像显示，抑郁症患者海马体积明显小于正常人[4]，突触重塑对于海马神经元细胞形态的维持与改变有着密切关联，体内体外实验证实抑郁发生时伴随较高的细胞凋亡的发生，对患者尸检结果显示抑郁发生后mTOR磷酸化水平降低，并且细胞自噬标志性蛋白beclin 1和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)表达升高[5]，提示细胞凋亡和细胞自噬可能参与抑郁的发生发展，并且靶向细胞自噬和mTOR信号通路有可能是治疗甚至是预防抑郁的新思路。目前，关于SSRI类药物氟西汀(fluoxetine)治疗抑郁症的机制，大家无争议地认为氟西汀是通过抑制5-HT转运体、增加突触间隙中5-HT的含量来发挥作用的[6]。但是关于氟西汀治疗抑郁的具体的信号通路，尤其是结合突触重塑与mTOR和细胞自噬信号通路关系的研究几乎未见涉及。本实验以慢性不可预见性温和刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)结合孤养法建立大鼠抑郁模型，采用Western blotting和逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)等分子生物学方法检测氟西汀干预治疗后大鼠海马突触重塑和相关信号通路关键蛋白表达水平的变化，以探讨氟西汀对抑郁发生的信号通路调控作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 动物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只由浙江省实验动物中心提供，体重190 g～210 g。

1.2 试剂和仪器 兔抗beclin 1和LC3抗体(Abcam)；兔抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和 突触泡蛋白(synaptophysin,SYP)抗体(武汉博士德生物公司)；兔抗Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、mTOR、p-mTOR、 4EBP1、p-4EBP1、β-actin和山羊抗兔 II 抗(CST)；氟西汀(礼来苏州制药有限公司)。动物行为自动跟踪分析系统(Ethovision 3.0，Noldus)。

2 方法

2.1 实验分组 将大鼠适应性饲养1周(12 h光照、12 h黑暗，黑暗时间20:00～8:00)，期间大鼠自由进食饮水。将大鼠随机分为3组(每组20只)：对照(control)组、CUMS组和fluoxetine组。

2.2 给药方法 在CUMS刺激2周后给予氟西汀组灌胃氟西汀2周，每次给药前将氟西汀溶于生理盐水，给药时间为每天9:00～11:00。氟西汀按照20 mg/kg[7]进行灌胃，对照组及CUMS组在相同时间灌胃等体积的生理盐水。

2.3 CUMS抑郁模型的建立 联合应用CUMS和孤养法建立抑郁模型。刺激包括鼠笼45 度倾斜2 h，黑白颠倒，行为限制2 h，禁食24 h，夹尾1 min，潮湿垫料24 h，禁水24 h，4 ℃冰水游泳5 min，悬尾20 min。上述9种应激随机安排，每天1种刺激，持续28 d，同一刺激不连续出现，使大鼠无法预见刺激。

2.4 动物行为学评定 给药完毕完成3组大鼠的行为学测定。 (1)糖水偏好实验：实验前动物已进行糖水适应性训练。禁水12 h后(20:00～8:00)，在8:00～9:00进行糖水实验。给予动物事先称量好的2瓶水，1瓶为1%蔗糖溶液，1瓶为动物日常饮用水。1 h后，记录并计算动物的糖水偏好[糖水偏好(%)=糖水减少质量/总液体减少质量×100%]；(2)旷场实验：旷场大小为120 cm×90 cm×35 cm，实验在9:00～12:00进行。将大鼠置于旷场中心内，使用动物行为自动跟踪系统记录并分析大鼠在旷场内5 min的行为，主要观测指标为总行程、中间停留时间。每只动物单独测试，2只动物测试之间将场地清理干净。

2.5 标本采集 动物麻醉后断头，取出大脑并在冰上迅速速剥离海马组织，置于-80 ℃冰箱保存待用。

2.6 RNA的提取及RT-PCR检测 应激结束后第2 天，断头处死大鼠，冰上快速剥离海马组织，液氮研磨并用TRIzol法提取海马总RNA，然后用Fermentas逆转录试剂盒通过两步法合成cDNA，配制反应体系进行RT-PCR，在凝胶成像系统拍下电泳图片后，用软件ImageJ分析基因相对灰度值表示，即目的基因与β-actin灰度测量比值。 SYP的上游引物为5’-CATCTTCGCCTTTGCTACG-3’，下游引物为 5’-CACTGAGGTGTTGAGTCCTGA-3’；GFAP的上游引物为5’-TGGTATCGGTCCAAGTTTGC-3’，下游引物为5’-TTGGCGGCGATAGTCATTAG-3’；beclin 1的上游引物为5’-TAATGTGGGGAAGGGACAAG-3’，下游引物为5’-AAATCCTCCACATCTCAAACA-3’； LC3的上游引物为5’-CCTGCTGCTGGCCGTAGT-3’，下游引物为5’-TGATGAAGTCTTCCTGCCAAAA-3’；β-actin的上游引物为5’-TCAGGTCATCACTATCGGGCAAT-3’，下游引物为5’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’。

2.7 蛋白的提取Western blotting检测 取出海马组织后加组织裂解液，冰上裂解30 min后4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)测定各样品蛋白浓度。取适量蛋白样品，加上样缓冲液煮沸变性后，进行SDS-PAGE(先80 V/30 min后换110 V/70 min)、凝胶浓度12%；并转移至PVDF膜(0.45/0.22 μm)，转膜条件为电流260 mA约90 min；于5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入抗SYP(1∶500)、GFAP(1∶500)、beclin 1(1∶2 000)、LC3(1∶2 000)、Bcl-2(1∶1 000)、caspase 3(1∶1 000)、cleaved caspase-3(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、4EBP1(1∶1 000)、p-4EBP1(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗体 I 抗孵育过夜，洗膜后加入辣根过氧化物标记的 II 抗(1∶1 000)。化学发光法显影，应用软件ImageJ分析蛋白相对灰度值。

3 统计学处理

所有实验均重复3次以上，数据采用GraphPad Prism 5.0和SPSS 17.0处理。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，各组间计量资料的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，用SNK-q检验法进行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 对照组、CUMS组和氟西汀组体重及行为学指标的比较

由表1可知，CUMS组体重、糖水偏好、旷场实验总行程和中间停留时间明显低于正常对照组。与CUMS组相比，氟西汀组体重、糖水偏好、旷场实验总行程和中间停留时间明显提高，差异有统计学显著性。氟西汀组和正常对照组相比差异无统计学显著性。

表1 3组之间体重、糖水摄取及行为学指标的变化

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCUMS.

2 氟西汀作用后CUMS海马突触重塑相关蛋白表达上调

与对照组相比，CUMS组突触重塑相关蛋白SYP和GFAP的mRNA和蛋白水平表达降低，差异有统计学显著性；而与CUMS组相比，无论是mRNA还是蛋白水平，氟西汀组的SYP和GFAP均上调，并且差异有统计学显著性；对照组和氟西汀组之间的差异无统计学显著性，见图1。这说明氟西汀可以通过改善海马突触重塑缓解和治疗抑郁症。

3 氟西汀作用后CUMS海马细胞凋亡水平下调

与对照组相比，CUMS组的Bcl-2蛋白表达降低而cleaved caspase-3的蛋白水平升高，差异有统计学显著性；氟西汀处理后可以逆转此现象；对照组和氟西汀组之间差异无统计学显著性，见图2。这说明氟西汀作用后CUMS海马细胞凋亡水平降低，氟西汀可以通过降低凋亡水平来缓解抑郁症状。

4 氟西汀作用后CUMS海马mTOR信号通路上调

由图3可见，与对照组相比，CUMS组的mTOR及其下游靶分子4EBP1的磷酸化水平降低，差异有统计学显著性；而与CUMS组相比，氟西汀组的mTOR及其下游靶分子4EBP1的磷酸化水平升高，差异有统计学显著性；对照组和氟西汀组之间差异无统计学显著性。这说明氟西汀作用后CUMS海马的mTOR信号通路上调，由此推测氟西汀通过影响mTOR信号通路调控突触重塑蛋白的表达。

5 氟西汀作用后CUMS海马细胞自噬水平下调

与对照组相比，CUMS组的自噬相关蛋白beclin 1和LC3 的mRNA和蛋白表达水平升高，尤其是LC3 II蛋白表达明显上调，差异有统计学显著性；与CUMS组相比，无论是mRNA还是蛋白水平，氟西汀组的beclin 1和LC3均下调，且差异有统计学显著性；对照组和氟西汀组之间的差异无统计学显著性，见图4。

Figure 1.The mRNA (A) and protein (B) expression of synaptic plasticity-related proteins SYP and GFAP in different groups. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCUMS.

图1 突触重塑相关蛋白SYP和GFAP的变化

Figure 2.The changes of apoptosis signaling pathway-related proteins Bcl-2 and caspase-3 in fluoxetine-treated CUMS rats. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCUMS.

图2 氟西汀作用后凋亡信号通路相关蛋白Bcl-2和cleaved-caspase-3的变化

Figure 3.The phosphorylation levels of mTOR signaling pathway-related proteins mTOR and 4EBP1 in fluoxetine-treated CUMS rats. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCUMS.

图3 氟西汀作用后mTOR信号通路相关蛋白mTOR和4EBP1的磷酸化水平变化

讨 论

抑郁症是威胁人类健康和幸福的疾病之一，临床数据显示，高达45%的抑郁症患者治疗后并未改善，甚至有15%的患者对抗抑郁药物没有任何反应[2]，因此，现有药物的作用机制并没有完全搞清楚，寻找新的抗抑郁药物固然重要，但我们更宜挖掘现有的抗抑郁药物的抗抑郁新机制以省去大量的人力、物力和财力。CUMS可以有效地模拟人类抑郁症状，成为抑郁症研究中广泛使用的模型[8-9]。本研究结果显示，CUMS组大鼠在体重、糖水摄取量、旷场实验运动总距离和中间停留时间较正常对照均减少，说明大鼠表现出兴趣丧失和快感缺乏等抑郁症状，抑郁模型建立成功。而氟西汀治疗后，上述抑郁症状均明显改善，这与国内外的一些研究结果相一致。

Figure 4.The mRNA (A) and protein (B) expression of autophagy-related proteins beclin 1 and LC3 in fluoxetine-treated CUMS rats. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCUMS.

图4 氟西汀作用后自噬相关蛋白beclin 1和LC3的变化

突触重塑对于海马神经元细胞形态的维持与改变有着密切关联。GFAP是星形胶质细胞的标志性蛋白，可以激活星形胶质细胞产生多种神经营养因子，对突触重塑起到关键作用。研究证实在抑郁症、精神分裂症、双向情感障碍等患者的脑内检测GFAP表达均下降，并导致突触重塑和神经传导等功能的异常[10]。突触泡蛋白SYP是神经元和神经内分泌细胞突触小泡上的一种膜蛋白，通过激活蛋白酪氨酸激酶，使自身磷酸化并调节内源性谷氨酸的分泌来调节突触可塑性[11]。研究发现，在长期皮下注射皮质酮诱导形成的抑郁样小鼠模型，SYP表达明显下调，并出现神经元功能障碍[12]。结果显示，抑郁模型GFAP和SYP在mRNA和蛋白水平表达下调，突触重塑受到破坏；氟西汀治疗后，抑郁大鼠海马GFAP和SYP mRNA和蛋白水平表达明显上调，突触重塑得到改善。

细胞凋亡普遍存在于生物界，体内体外实验证实抑郁发生时伴随较高的细胞凋亡水平。最新研究显示，氟西汀干预后，肺炎球菌性脑膜炎大鼠海马凋亡比例明显减小[13]；也有报道指出，氟西汀可以通过诱导AMPAR介导的钙离子依赖性细胞凋亡来抑制恶性胶质瘤的生长[14]；可见氟西汀对不同的疾病有着不同的凋亡调控方式。本实验结果显示，氟西汀作用后，CUMS组海马凋亡水平明显下调，这与抑郁后海马体积缩小也相吻合。

mTOR是一种保守的非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸化下游靶基因4EBP1和p70S6K调控多种基因转录和蛋白翻译[15]，在细胞生长分化凋亡过程中发挥重要的调控作用。本实验结果显示，CUMS组mTOR和4EBP1磷酸化水平均下调，而氟西汀作用后，mTOR和4EBP1磷酸化水平均上调，所以我们认为，氟西汀可以通过提高mTOR磷酸化水平继而提高下游靶分子4EBP1的磷酸化水平，最终促进突触重塑相关蛋白的表达来发挥抗抑郁作用。

细胞自噬是一种保守的溶酶体代谢途径，可以包裹损伤的细胞器或错误折叠的蛋白进入溶酶体进行降解，对包括神经系统在内的多种组织的代谢和功能发挥具有重要意义。因此，细胞自噬水平改变，神经系统发育和突触重塑会受到影响，并引发神经性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病等[16]。抑郁患者海马组织中LC3蛋白上调，并且药物导致的长时程抑郁细胞模型自噬关键蛋白LC3 II表达明显上调[17]。最新研究显示一些抗抑郁药如盐酸舍曲林作用后引起自噬相关蛋白如beclin 1表达上调[18-20]，同样提示我们细胞自噬在抑郁发生发展中起到很关键的作用，抗抑郁药物有可能通过调节细胞自噬发挥抗抑郁作用。本研究结果显示，抑郁模型大鼠自噬相关蛋白LC3和beclin 1的mRNA和蛋白水平均上调，表明抑郁发生时自噬水平提高，细胞自噬可能参与抑郁的发生发展；氟西汀处理后，LC3和beclin 1在mRNA和蛋白水平表达均下调，自噬水平降低，氟西汀可能对自噬存在调控作用，氟西汀可能通过下调细胞自噬改善突触重塑性，并缓解抑郁症。

综上所述，氟西汀干预后，抑郁大鼠海马凋亡信号被抑制，细胞存活信号通路mTOR及下游靶分子磷酸化水平上调，突触重塑相关蛋白GFAP、SYP在mRNA和蛋白水平上调，自噬相关蛋白beclin 1、LC3在mRNA和蛋白表达均下调，突触重塑蛋白降解途径受到抑制，显示氟西汀可以通过调控以上信号通路缓解抑郁症状，改善抑郁状态下的突触重塑。因此我们提出假设，应激刺激刚开始时会出现短暂的自噬缺陷、细胞内积累错误折叠蛋白或者破损细胞器的累积，并发生抑郁或其它神经性疾病；随着错误折叠蛋白或者破损细胞器的累积，细胞逐渐发生高水平的凋亡，机体会做出适应性调节，激活细胞自噬降解积累的蛋白或者细胞器，甚至发生自噬性死亡，被某种分子或信号影响后，抑郁发生后mTOR信号通路下调，随之突触重塑蛋白表达降低或者被细胞自噬降解而减少；氟西汀干预后，凋亡水平降低，细胞自噬水平下调，突触蛋白降解减少，并且表达增多，受损组织状态逐渐改善。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Fluoxetine regulates hippocampal synaptic plasticity in CUMS depression rats

SHEN Zhong-fei, WANG Zhi-jian, PAN Wei-wei, GUO Yan-jun, FU Chun-yan, YUAN Feng-feng

(JiaxingCollegeofMedicine,Jiaxing314000,China.E-mail:shzhmy169@vip.sina.com)

AIM: To investigate the role of fluoxetine in the hippocampal synaptic plasticity in chronic unpredictable mild stress (CUMS) depression rats and its effect on mTOR and autophagy signaling pathways. METHODS: Male Sprague-Dawley rats (n=60) were randomly divided into normal control group, CUMS group and fluoxetine group. The CUMS rat model was established through CUMS combined with solitary raising, and fluoxetine (20 mg·kg-1·d-1) was administered via intragastric gavage. The changes of body weight, the ratio of sugar intake and the results of the behavioral test were recorded to identify the modeling. Moreover, the expression of synaptic plasticity-related proteins glial fibrillary acidic protein (GFAP) and synaptophysin (SYP), apoptosis-related proteins Bcl-2 and caspase-3, mTOR signaling proteins mTOR and 4EBP1, and autophagy-related proteins beclin 1 and LC3 were examined by RT-PCR and Western blot.RESULTS: Compared with control group, the body weight, sucrose intake, and total distance and intermediate residence time in the open field test were significantly decreased in CUMS group. The results of RT-PCR and Western blotting showed that the mRNA and protein levels of SYP and GFAP in CUMS group were significantly down-regulated compared with control group. The expression of Bcl-2 in CUMS group was downregulated, while the protein level of cleaved caspase-3 increased. Decreased phosphorylation levels of mTOR and its downstream target molecule 4EBP1 were observed in CUMS group. Besides, the autophagy-related proteins beclin 1 and LC3 were significantly upregulated at mRNA and protein levels. All these results(upregulation or downregulation) were attenuated by the treatment with fluoxetine, and the difference was statistically significant. CONCLUSION: Fluoxetine might improve hippocampal synaptic plasticity and alleviate symptoms of depression by supressing apoptosis/autophagy signaling pathways and upregulating mTOR signaling pathway.

Fluoxetine; Depression; Synaptic plasticity; Apoptosis; mTOR signaling pathway; Autophagy

杂志网址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1642- 06

2015- 12- 16

2016- 07- 12

浙江省实验动物科技计划项目(No. 2014C37019)； 嘉兴市科技局项目(No. 2015AY23066)

△通讯作者 Tel: 0573-83643850; E-mail: shzhmy169@vip.sina.com

R741

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.018