WNT5B过表达对人乳腺癌MCF-7细胞活力及凋亡的影响

周凡涵， 厉红元

(重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科，重庆 400016)



WNT5B过表达对人乳腺癌MCF-7细胞活力及凋亡的影响

周凡涵， 厉红元△

(重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科，重庆 400016)

目的： 检测WNT5B在人正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞株中的表达，及过表达WNT5B后对人乳腺癌MCF-7细胞活力及凋亡的影响，探讨WNT5B在乳腺癌发生发展中的作用。方法：采用RT-PCR法检测正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞中WNT5B的mRNA表达水平，将WNT5B的表达载体pcDNA3.1/WNT5B和空白对照载体pcDNA3.1分别瞬时转染人乳腺癌MCF-7细胞，通过real-time PCR和Western blotting法分别在mRNA和蛋白水平验证WNT5B的表达效率；并通过CCK-8的方法检测WNT5B过表达对人乳腺癌MCF-7细胞活力的影响，通过流式细胞术分别检测过表达WNT5B对MCF-7细胞周期分布及凋亡比例的影响。结果：与正常乳腺上皮细胞相比，WNT5B在乳腺癌细胞中低表达；在乳腺癌细胞MCF-7中转染WNT5B表达质粒后，WNT5B表达上调，差异有统计学显著性(P<0.05)；与对照组相比，过表达WNT5B后，MCF7细胞的活力明显降低，处于S期细胞的量明显增加，G1和G2/M期细胞明显减少，且细胞凋亡比例明显增加，差异均有统计学显著性(P<0.05)。结论：WNT5B在乳腺癌细胞中低表达，过表达WNT5B可使人乳腺癌细胞MCF-7阻滞在S期，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。

WNT5B； MCF-7细胞； 细胞凋亡

乳腺癌是严重威胁妇女身心健康的恶性肿瘤之一，其发病率在国内有逐年上升趋势，虽然近年来对乳腺癌发病机理的研究已越来越广泛，并且发现了多种因子及信号通路参与了乳腺癌的发生发展，但其在分子水平的发病机制尚需继续探讨[1-2]。

WNT信号通路功能广泛、机制复杂，WNT5B作为WNT通路众多配体之一，以旁分泌或自分泌的方式参与非经典WNT通路[3]，并参与调控了多种肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭转移等过程[4-5]。有报道证实WNT5B的表达与结肠癌细胞的分化程度呈正相关，过表达WNT5B抑制WNT信号通路关键分子β-catenin的表达，促进细胞凋亡[6-7]。然而WNT5B在乳腺癌细胞中的研究较少。本研究探讨WNT5B在人正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞中的表达情况，并通过构建WNT5B真核过表达载体，上调WNT5B在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达，研究过表达WNT5B后对人乳腺癌细胞MCF-7增殖与凋亡的影响，探讨WNT5B在乳腺癌发生发展中的作用，进而为乳腺癌的基因靶向治疗提供新的实验依据。

材 料 和 方 法

1 主要试剂与质粒

1.1 主要试剂 Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen；总RNA提取试剂盒购自Omega；RNA逆转录试剂盒购自TaKaRa；蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物；兔抗人WNT5B的I 抗购自Santa Cruz；β-actin的I抗购自北京鼎国生物技术有限公司，ECL发光试剂盒购自Thermo。

1.2 WNT5B真核过表达载体的构建 根据WNT5B基因在GenBank中的cDNA序列(NM_030775)设计特异性引物，上游引物为5’-CCGctcgagATGCCCAGCCTGCTGCTG-3’(含XhoI酶切位点)，下游引物为5’-CGCggatccTTTACAGATGTACTGGTCCACGA-3’(含BamH I酶切位点)，引物由上海生工合成。提取乳腺癌细胞MCF-7总RNA，并以逆转录获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，胶回收，按照pcDNA3.1操作手册构建重组载体，测序和酶切鉴定pcDNA3.1/WNT5B过表达载体。由实验室构建并保存。

2 方法

2.1 MCF-7细胞的培养与转染 MCF-7细胞由重庆医科大学附属第一医院分子肿瘤及表观遗传学实验室储存，培养于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。实验分为空载体组(pcDNA3.1)和实验组(pcDNA3.1/WNT5B)。转染前24 h消化收集细胞并计数，按每孔1×105个接种入6孔培养板中，当细胞融合达到70%～80%时,按脂质体Lipofectamine 2000说明书分别转染pcDNA3.1/WNT5B和空载体pcDNA3.1，培养48 h提取总RNA，72 h提取总蛋白。

2.2 Real-time PCR法检测WNT5B的mRNA表达水平 细胞转染48 h后分别提取各组细胞的总RNA，反转录获得cDNA。用于Real-time PCR检测WNT5B的上游引物为5’-AAATGCCACGGCGTC-TCG-3’，下游引物为5’-GGG TGAAGCGGCTGTTGA-3’；β-actin的上游引物为5’-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3’，下游引物为5’-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’。Real-time PCR的反应条件为95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s， 39个循环；65 ℃ 15 s。采用 2-ΔΔCt法计算并分析mRNA的相对表达量。

2.3 Western blotting法检测WNT5B蛋白的表达水平 细胞转染48 h后分别提取各组细胞的总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度，加适量上样缓冲液100 ℃煮沸变性5 min，按每孔上样量为40 mg进行SDS-PAGE后，电转至PVDF转印膜上，用含5%脱脂奶粉PBST液封闭2 h；鼠抗人WNT5B单克隆抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜；PBST清洗 10 min 3次；加羊抗鼠II抗(1∶1 000)室温孵育40 min；用ECL化学发光法检测并计算WNT5B蛋白的相对表达量。

2.4 CCK-8检测过表达WNT5B对MCF细胞活力的影响 转染24 h的各组细胞消化收集，按每孔2 000个接种于96孔中，待细胞贴壁后记为1 d，分别在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d加入10 mL CCK-8液，37 ℃孵育2 h后，在450 nm处测定吸光度(A)值。

2.5 细胞凋亡的检测 转染48 h后用不含EDTA的胰酶消化各组细胞，1 000 r/min离心收集，按照Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒操作步骤上流式细胞仪检测细胞凋亡。

2.6 细胞周期分布的检测 转染72 h后消化收集各组细胞，预冷70%无水乙醇-20 ℃过夜固定细胞，加入500 μL含碘化丙啶的PBS，4 ℃静置30 min，洗涤后流式细胞仪上检测细胞周期分布。

3 统计学处理

统计分析采用SPSS 19.0进行，所有数据均以均值±标准差(mean±SD)表示，两组间参数比较采用独立样本t检验，多组间参数两两比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 WNT5B在乳腺正常上皮和不同乳腺癌细胞中的表达

Real-time PCR的结果显示，与人正常乳腺上皮细胞MCF10A相比，WNT5B在人乳腺癌细胞株T47D、MCF-7和MDA-MB-231中低表达，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The mRNA expression of WNT5B in different breast cancer cell lines detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsMCF-10A.

图1 WNT5B mRNA在不同乳腺癌细胞中的表达情况

2 载体转染MCF-7细胞效率的检测

Real-time PCR和Western blot实验的结果显示，与空载体组相比，实验组MCF-7细胞中WNT5B在mRNA和蛋白水平上的表达明显增加，差异均有统计学显著性(P<0.05),见图2、3。这说明转染成功，可进行后续实验。

Figure 2.The mRNA expression of WNT5B in the MCF-7 cells. detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector group.

图2 ReaL-time PCR检测MCF-7细胞中WNT5B mRNA的表达

3 WNT5B过表达对乳腺癌 MCF-7细胞活力的影响

通过CCK-8的方法检测WNT5B过表达对MCF7细胞活力的影响，结果如图4所示。与对照组相比，过表达WNT5B的人乳腺癌细胞MCF7的细胞活力明显下降，差异具有统计学显著性(P<0.05)。

Figure 3.The protein expression of WNT5B in MCF-7 cells detected by Western blotting. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector group.

图3 MCF-7细胞中WNT5B在蛋白水平的表达

Figure 4.The effect of WNT5B up-expression on the viability of MCF-7 cells measured by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.

图4 经CCK-8检测，过表达WNT5B的MCF-7细胞活力低于对照组细胞

4 过表达WNT5B对乳腺癌MCF7细胞周期分布的影响

流式细胞术检测细胞周期的结果显示，与空载体组相比，实验组中S期细胞数量明显增加，G1和G2/M期细胞数量减少，说明过表达WNT5B可将乳腺癌细胞阻滞在S期，差异有统计学显著性(P<0.05),见图5。

5 过表达WNT5B对乳腺癌MCF7细胞凋亡的影响

流式细胞术检测凋亡的结果显示，过表达WNT5B后，与空载体组相比实验组中细胞凋亡的比例明显增加(P<0.05)，见图6。这说明过表达WNT5B能促进乳腺癌细胞的凋亡。

Figure 5.The cell cycle was examined by flow cytometry in the MCF-7 cells with WNT5B over-expression by transfection with plasmid pcDNA3.1/WNT5B for 72 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvector group.

图5 流式细胞术检测过表达WNT5B对乳腺癌MCF-7细胞周期分布的影响

Figure 6.The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry in the MCF-7 cells with WNT5B over-expression by transfection with plasmid pcDNA3.1/WNT5B for 28 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector group.

图6 流式细胞术检测过表达WNT5B对乳腺癌MCF-7细胞凋亡比例的影响

讨 论

乳腺癌是一种全身性疾病，其发生发展的机制复杂，近几年乳腺癌的发病率在我国逐年攀升[7]，而其治疗的方法仍没有较大的改善，因此探索分子水平上或其相关领域更有效、更安全的治疗方法成为乳腺癌研究领域的当务之急。当前针对WNT信号通路与乳腺癌的研究受到重视[8-9]。WNT5B作为WNT通路众多配体之一，通过WNT信号通路参与了肿瘤的发生发展。文献报道WNT5B在乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤中低表达[10-12]；Bradley等[5]研究发现在骨肉瘤细胞中WNT5B通过抑制JNK信号的中断影响软骨细胞的增殖与迁移；Kato等[13]在人肺癌A549细胞和人胰腺癌Panc-1细胞中的研究发现，WNT5B参与了上皮细胞向间质细胞的转化，进而影响肿瘤细胞的侵袭能力，促进肿瘤的恶性增殖，提示WNT5B对肿瘤细胞的增殖、迁移、分化等过程起着重要作用。

我们的前期研究发现，与癌旁组织相比WNT5B在乳腺癌组织中明显低表达，且与肿瘤大小显著相关[11]。然而WNT5B在乳腺癌细胞中的表达及具体的分子作用机制是未知的；基于此，本研究首先探讨了WNT5B在正常乳腺上皮细胞和不同乳腺癌细胞中的表达，结果显示WNT5B在乳腺癌细胞中明显低表达，与前期研究结果一致。为了研究WNT5B在乳腺癌发生发展中的作用，成功构建了WNT5B的真核过表达载体，瞬时转染入人乳腺癌细胞MCF-7。研究结果发现过表达WNT5B后，MCF7细胞活力受到明显抑制，而细胞周期被阻滞在S期，细胞凋亡比例也明显增加，表明在乳腺癌细胞中，低表达的WNT5B可能作为肿瘤抑制因子，参与调节乳腺癌的发生与发展，然而WNT5B是如何靶定相关信号通路或转录因子发挥作用，仍不明确，这也是我们下一步工作的重点。

综上所述，WNT5B可能作为抑癌因子调控人乳腺癌细胞MCF-7的增殖与凋亡，但其具体机制及所涉及的信号转导途径尚不明确，是否与非经典的WNT信号通路相关，有待于进一步研究，同时本实验可为乳腺癌的基因治疗提供新的思路。

[1] Yin Y, Yang Z, Zhang S. Combined treatment with exogenous estradiol and progesterone increases the incidence of breast cancer in TA2 mice without ovaries[J]. Cancer Lett，2011,311(2):171-176.

[2] Brennan KR, Brown AM. Wnt proteins in mammary development and cancer[J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2004, 9(2):119-131.

[3] Nusse R. TheWntgene family in tumorgenesis and in normal development[J]. J Steroid Biochem Mol Biol，1992，43(1-3): 9-12.

[4] Wodarz A, Nusse R.Mechanisms of WNT signaling in development[J]. Annu Rev Cell Dev Biol，1998， 14: 59-88.

[5] Bradley EW, Drissi MH.Wnt5b regulates mesenchymal cell aggregation and chondrocyte differentiation through the planar cell polarity pathway[J]. J Cell Physiol, 2011, 226(6):1683-1693.

[6] Hughes KR, Sablitzky F, Mahida YR.Expression profiling of Wnt family of genes in normal and inflammatory bowel disease primary human intestinal myofibroblasts and normal humancolonic crypt epithelial cells[J]. Inflamm Bowel Dis， 2011，17(1):213-220.

[7] 刘 伟， 周 兵， 张 红， 等. Wnt-5b 在结肠癌中的表达及对结肠癌细胞的影响[J]. 生命科学研究, 2013, 17(5):427-430.

[8] Roy C, Choudhury KB, Saha A, et al.Metaplastic carcinoma of the breast: a case report with review of literature[J]. Indian J Cancer, 2014, 51(3):381-383.

[9] Willert K, Brown JD, Danenberg E. Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors[J]. Nature, 2003, 423(6938):448-452.

[10]Yuzugullu H, Benhaj K, Ozturk N, et al. Canonical Wnt signaling is antagonized by noncanonical Wnt5a in hepatocellular carcinoma cells[J]. Mol Cancer， 2009, 8:90.

[11]Sun D, Qin L, Xu Y, et al. Influence of adriamycin on changes in Nanog, Oct-4, Sox2, ARID1 and Wnt5b expression in liver cancer stem cells[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(22):6974-6980.

[12]刘洪涛， 周凡涵， 申媛媛， 等. WNT5B在乳腺癌中的表达及意义[J]. 中国病理生理杂志, 2015, 31(6):1032-1035.

[13]Kato S, Hayakawa Y, Sakurai H,et al. Mesenchymal-transitioned cancer cells instigate theinvasion of epithelial cancer cells through secretion of WNT3 and WNT5B[J]. Cancer Sci, 2014, 105(3):281-289.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Effects of WNT5B over-expression on viability and apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7

ZHOU Fan-han, LI Hong-yuan

(DepartmentofEndocrineandBreastSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:L_hongyan@yeah.net)

AIM: To detect the expression of WNT5B in normal breast epithelial cells and different breast cancer cell lines, and to investigate the effects of WNT5B over-expression on the viability and apoptosis of human breast cell line MCF-7.METHODS: The mRNA expression of WNT5B was detected by RT-PCR in different breast cancer cells. MCF-7 cells were transfected with plasmid pcDNA3.1/WNT5B or pcDNA3.1, and the expression of WNT5B at mRNA and protein levels was examined in the 2 groups by real-time PCR and Western blotting, respectively. Subsequently, the changes of cell viability and cell apoptosis were analyzed by CCK-8 assay and flow cytometry, respectively. RESULTS: The expression of WNT5B in the breast cancer cell lines was lower than that in MCF10A cells. The WNT5B expression in the MCF-7 cells in experimental group was significantly higher than that in vector group (P<0.05). However, the cell viability in experimental group decreased significantly as compared with vector group (P<0.05). The number of the cells in S-phase obviously increased, while the percentage of the cells in G1-phase and G2/M-phase decreased compared with vector group. The number of apoptotic cells in WNT5B group was significantly higher than that in vector group. CONCLUSION: The expression of WNT5B is decreased in breast cancer cells. WNT5B over-expression significantly inhibits the cell growth and promotes the cell apoptosis in breast cancer MCF7 cells.

WNT5B; MCF-7 cells; Apoptosis

杂志网址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1594- 05

2016- 04- 01

2016- 07- 13

△ 通讯作者 Tel: 13883310407； E-mail: L_hongyan@yeah.net

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.011