GSTP1上调对奥沙利铂诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响*

刘润田， 安聪静， 白 云， 郑建兴

(河北医科大学第二医院 1肝胆外科， 2体检中心， 河北 石家庄 050000； 3河北省人民医院消化内科， 河北 石家庄 050057； 4唐山市工人医院肝胆外科, 河北 唐山 063000)



GSTP1上调对奥沙利铂诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响*

刘润田1△， 安聪静2， 白 云3， 郑建兴4

(河北医科大学第二医院1肝胆外科，2体检中心， 河北 石家庄 050000；3河北省人民医院消化内科， 河北 石家庄 050057；4唐山市工人医院肝胆外科, 河北 唐山 063000)

目的： 探讨过表达GSTP1后HepG2细胞对奥沙利铂(oxaliplatin，OXA)敏感性的影响及其相关机制。方法: 采用腺病毒载体转染人肝癌细胞株HepG2，获得过表达GSTP1的HepG2细胞；实验分为空白对照组(control组)、载体组(vehicle组)、过表达GSTP1组(Ad-GSTP1组)、OXA组、OXA+vehicle组和Ad-GSTP1+OXA组；MTT法和流式细胞术检测HepG2细胞的存活率和凋亡率；Western blot法检测HepG2细胞中GSTP1、Akt、mTOR、p-Akt和p-mTOR的蛋白水平。结果: OXA剂量依赖性地降低HepG2细胞的存活率(P<0.05)；腺病毒转染后HepG2细胞的GSTP1蛋白表达增加；基础状态下，过表达GSTP1可降低HepG2细胞的存活率，促进细胞凋亡，抑制Akt和mTOR磷酸化水平(P<0.05)；给予OXA处理后，上调GSTP1表达增强了OXA降低HepG2细胞存活率的作用，凋亡率进一步增加，Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平进一步下降，与加药组相比差异有统计学显著性(P<0.05)。结论: 上调GSTP1表达可增强OXA促进HepG2细胞凋亡的作用，其机制可能与Akt/mTOR通路有关。

GSTP1； 奥沙利铂； 细胞凋亡的作用； HepG2细胞

原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤，由于起病位置隐匿，早期诊断困难，且生长迅速，具有高度侵袭性，大部分患者在临床上确诊时已发展到局部晚期，或已发生转移，只有约20%的患者适合手术切除[1]。全球肝癌致死率仅次于肺癌和胃癌，位居第3位[2]。而我国肝癌的发病人数占全球的55%，居全球第1[3]，严重地威胁人民的健康和生命。

奥沙利铂(oxaliplatin，OXA)是在顺铂和卡铂之后的第3代铂类抗癌药，疗效良好，不良反应和毒性反应更低，其作用机理是通过以DNA为靶作用部位，阻断其复制和转运，以及抑制RNA的合成[4]。Wang等[5]研究发现，奥沙利铂具有抑制人肝癌细胞系Hep3B和HCCLM3的增殖，主要是通过诱导细胞凋亡而发挥作用。2010年，国内报道[6]指出奥沙利铂与复方苦参注射液联用可抑制SMMC-7721细胞的增殖，通过将细胞阻滞于G0/G1期诱导细胞凋亡，两药联用起协同增效的作用。近年来大量样本研究结果表明，许多肿瘤的发病危险性与谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneS-transferases，GSTs)多态性明显相关。GSTs 的基因多态性可引起酶分子结构、功能和水平的改变，从而影响细胞的解毒能力。本实验建立过表达GSTP1的HepG2细胞，观察其对奥沙利铂敏感性的变化。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌细胞株HepG2购自中南大学湘雅医院细胞中心；过表达GSTP1腺病毒(Ad-GSTP1)及病毒载体购自上海和元生物有限公司；RPMI-1640培养基、MTT试剂购自Sigma；抗Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR抗体购自Santa Cruz；胎牛血清购自上海澳赛尔斯公司；MTT溶液购自森贝伽生物公司；其它试剂为国产分析纯。

2 方法

2.1 细胞培养与分组 将人肝癌细胞株HepG2常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞生长至密度为80%～90%时，采用0.25%胰蛋白酶消化传代。实验分为空白对照组(control组)、载体组(vehicle组)、过表达GSTP1组(Ad-GSTP1组)、OXA组、OXA+vehicle组和Ad-GSTP1+OXA组。

2.2 腺病毒载体转染 腺病毒转染前18 h，将HepG2细胞以每孔1×105铺到96孔板中；待转染时培养至约每孔2×105。更换含6 mg/L聚凝胺的新鲜培养基(2 mL)，加入适量病毒悬液，于37 ℃孵育24 h，用新鲜培养基更换含病毒的培养基，继续培养，48 h后可见明显荧光表达。

2.3 MTT法检测细胞存活率 将处于对数期的HepG2细胞接种于96孔板，分别加入奥沙利铂1、5、10、20和40 μmol/L，培养24 h后加入5 g/L MTT溶液20 μL，继续孵育4～6 h后，离心去上清，加入DMSO 100 μL，轻轻振荡5 min，以570 nm为测试波长，630 nm为参考波长，在酶标仪下读取吸光度(A)值。每组设3个复孔。另收集经相应处理各组细胞检测存活率。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 收集经相应处理的各组细胞，1 000 r/min离心5 min，弃去培养液，PBS洗涤2次，制备单细胞悬液，用75%冰乙醇固定，4 ℃过夜。PBS洗涤，离心，去除乙醇，加入1% RNA酶Tri-HCl缓冲液，100 mg/L碘化丙啶(propi-dium iodide，PI)染色液染色，4 ℃避光反应30 min，采用流式细胞仪进行检测。

2.5 Western blot法检测蛋白表达 收集经相应处理各组细胞，用裂解液裂解，Bardford法进行蛋白定量。在10% SDS-聚丙烯凝胶中电泳2 h，电转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h，加入相应 I 抗，4 ℃过夜，TBST洗涤3次，再加入相应 II 抗，室温孵育30 min，化学发光法显色，成像扫描分析系统扫描并保存图像。

3 统计学处理

所有数据均在SPSS 15.0统计软件中进行统计，实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示，多组数据的比较用单因素方差分析，各组均数间的两两比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MTT法测定HepG2细胞存活率的变化

浓度为1、5、10、20和40 μmol/L的奥沙利铂处理HepG2细胞24 h后，MTT实验结果显示奥沙利铂呈浓度依赖性降低HepG2细胞的存活率。如图1所示，20 μmol/L与40 μmol/L奥沙利铂对HepG2细胞的存活率差异没有统计学显著性，由此在后续实验中均采用20 μmol/L的浓度。

2 腺病毒转染后各组细胞的存活率

如图2所示，Ad-GSTP1 HepG2细胞的存活率显著低于control组(P<0.05)；OXA组与OXA+vehicle组细胞的存活率低于Ad-GSTP1组和control组(P<0.05)；过表达GSTP1同时给予20 μmol/L奥沙利铂处理24 h，HepG2细胞的存活率显著低于其它各组(P<0.05)。这提示上调GSTP1表达可增强奥沙利铂对HepG2细胞存活率的抑制作用。

Figure 1.The effect of oxaliplatin (OXA) on the survival rate of HepG2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

图1 不同浓度奥沙利铂对HepG2细胞存活率的影响

Figure 2.The changes of survival rates in the HepG2 cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOXA group.

图2 各组HepG2细胞存活率变化的比较

3 转染后GSTP1蛋白的表达

与空白对照组相比，Ad-GSTP1组的GSTP1蛋白表达显著升高(P<0.05)，见图3。

4 流式细胞术检测细胞凋亡

如图4所示，Ad-GSTP1组HepG2细胞的凋亡率显著高于空白对照组(P<0.05)；OXA组和OXA+vehicle组HepG2细胞的凋亡率显著高于空白对照组和Ad-GSTP1组(P<0.05)；过表达GSTP1同时给予同时给予20 μmol/L奥沙利铂处理后，HepG2细胞的凋亡率显著高于其它各组(P<0.05)。这提示过表达GSTP1可增强奥沙利铂促进HepG2细胞凋亡的作用。

Figure 3.The protein expression of GSTP1 in the HepG2 cells after transfection.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图3 转染Ad-GSTP1后HepG2细胞中GSTP1的蛋白表达

表达GSTP1可增强奥沙利铂促进HepG2细胞凋亡的作用。

5 Western blot法检测Akt、mTOR、p-Akt和p-mTOR的蛋白水平

Ad-GSTP1组、OXA组和OXA+vehicle组的HepG2细胞中Akt和mTOR的蛋白水平无明显变化，但p-Akt和p-mTOR的蛋白水平显著低于空白对照组(P<0.05)；其中OXA组和OXA+vehicle组间差异无统计学显著性；Ad-GSTP1+OXA组细胞中的Akt和mTOR的蛋白表达水平也无显著变化，p-Akt和p-mTOR的蛋白水平显著低于其它各组(P<0.05)，见图5。

讨 论

谷胱甘肽硫转移酶广泛存在于细胞液中，具有抗氧化、防癌、清除体内自由基及超氧阴离子的作用[7]。近年来大量样本研究结果表明，许多肿瘤的发病危险度与GSTs多态性明显相关。GSTs 的基因多态性可引起酶分子结构、功能和水平的改变，从而影响细胞的解毒能力，因此被认为与肿瘤易感性有关。GSTM3、GSTM1、GSTT1和GSTP1是GSTs的4种亚型，已被广泛证明具有多态性，可引起酶活性的改变[8-9]。

Figure 4.The changes of apoptotic rate in the HepG2 cells with different treatments.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOXA group.

图4 经相应处理后各组HepG2细胞凋亡的变化

奥沙利铂作为第3代铂类抗肿瘤药物，体内外研究表明其具有广泛抗肿瘤活性，对晚期或转移性肝癌有良好的临床疗效[10]。其中央铂原子被一草酸和1、2-二胺环己烷包围，呈反式构象，是一个立体异构体。与其它铂类衍生物一样，奥沙利铂通过产生烷化结合物作用于DNA，形成链内和链间交联，从而抑制DNA的合成及复制，而且它与DNA结合速度，最多需要15 min[11]。以奥沙利铂为主，联合5-FU和亚叶酸钙的化学治疗是目前晚期肝癌的重要治疗方法。但是对于奥沙利铂对肝癌的机制研究尚未深入，本实验观察奥沙利铂对肝癌细胞存活率与凋亡率的影响，通过免疫印迹法检测相关蛋白的表达，发现奥沙利铂对肝癌细胞增殖的抑制作用可能与Akt/mTOR信号通路有关。

Akt/mTOR信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，在维持肿瘤细胞增殖、存活和凋亡中发挥关键作用。当上游的PI3K激活后，会导致Akt的磷酸化，通过抑制TSC-1/TSC-2复合物的形成，使mTOR被激活，从而加快细胞周期[12]。本实验研究结果发现与单独采用奥沙利铂处理相比，过表达GSTP1能够加强奥沙利铂对HepG2细胞存活率的抑制作用和细胞凋亡的加速作用。且发现对p-Akt和p-mTOR的蛋白水平有显著的影响，推测GSTP1可能通过影响Akt/mTOR信号通路，通过抑制Akt的磷酸化，进一步抑制下游因子mTOR的激活，从而阻断Akt/mTOR信号通路，进而抑制HepG2细胞的增殖，影响HepG2细胞对奥沙利铂的敏感性，其具体机制需后续进一步研究。本实验的意义在于提高以奥沙利铂治疗为主的临床方案的有效率，从而提高患者总体的生存率。

Figure 5.The protein levels of Akt, mTOR, p-Akt and p-mTOR in each group.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图5 各组HepG2细胞中Akt、mTOR、p-Akt和p-mTOR的蛋白水平

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Over-expression of GSTP1 increases oxaliplatin-induced apoptosis in human hepatoma HepG2 cells

LIU Run-tian1, AN Cong-jing2, BAI Yun3, ZHENG Jian-xing4

(1DepartmentofHepatobiliarySurgery,2PhysicalExaminationCenter,TheSecondAffiliatedHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;3DepartmentofGastroenterology,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050057,China;4DepartmentofHepatobiliarySurgery,TangshanGongrenHospital,Tangshan063000,China.E-mail:liuyuntianmed@126.com)

AIM: To investigate the effect of GSTP1 over-expression on the sensitivity of human hepatoma HepG2 cells to oxaliplatin (OXA). METHODS: Adenovirus carrying GSTP1 (Ad-GSTP1) was used to infect HepG2 cells for establishing the cell line over-expressing GSTP1. The cells were randomly divided into 6 groups: control, vehicle, Ad-GSTP1, OXA, OXA+vehicle and OXA+Ad-GSTP1. The cell survival rates were examined by CCK-8 assay， and the apoptotic rates were analyzed by flow cytometry. The protein levels of GSTP1, Akt, mTOR, p-Akt and p-mTOR were determined by Western blot. RESULTS: OXA decreased the cell survival rate in a dose-dependent manner (P<0.05). The protein expression of GSTP1 increased after transfection with adenovirus. At basal level, up-regulation of GSTP1 significantly decreased the cell survival rate, increased the cell apoptosis， and inhibited the phosphorylation levels of Akt and mTOR (P<0.05). Moreover, GSTP1 over-expression enhanced the effect of OXA on the cell viability, cell apoptosis, and further inhibited the phosphorylation levels of Akt and mTOR (P<0.05). CONCLUSION: Over-expression of GSTP1 augments the enhanced effect of OXA on HepG2 cell apoptosis, which may be related to the inactivation of Akt/mTOR signaling pathway.

GSTP1; Oxaliplatin; Apoptosis; HepG2 cells

杂志网址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1579- 05

2016- 03- 28

2016- 05- 31

河北省医学科学研究重点课题计划(No.ZD20140110)；河北省卫生厅指令性课题(No.20090085)

△通讯作者 Tel: 0311-66002981； E-mail: liuyuntianmed@126.com

R735.7; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.008