土槿皮乙酸诱导脑胶质瘤细胞株U87阻滞于M期并发生凋亡*

何 露， 温创宇， 王慧慧， 杨湘玲， 刘焕亮2, ， 李 中， 5△

(中山大学附属第六医院 1神经科， 2检验科， 3广东省胃肠病学研究所，广东 广州 510655； 4中山大学中山医学院广东省脑功能与脑疾病重点实验室，广东 广州 510080； 5中山大学深圳研究院，广东 深圳518057)



土槿皮乙酸诱导脑胶质瘤细胞株U87阻滞于M期并发生凋亡*

何 露1, 4， 温创宇3， 王慧慧3， 杨湘玲3， 刘焕亮2, 3， 李 中1, 4， 5△

(中山大学附属第六医院1神经科，2检验科，3广东省胃肠病学研究所，广东 广州 510655；4中山大学中山医学院广东省脑功能与脑疾病重点实验室，广东 广州 510080；5中山大学深圳研究院，广东 深圳518057)

目的： 通过研究土槿皮乙酸对脑胶质瘤细胞株U87增殖与凋亡的影响，探讨土槿皮乙酸对脑胶质瘤的潜在应用价值。方法: 用不同浓度土槿皮乙酸处理U87细胞，并于不同时点观察细胞形态改变；采用MTS法对U87细胞进行细胞活力测定；采用流式细胞术和Western blot法检测土槿皮乙酸对细胞周期的影响；采用Anne-xin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡；利用Western blot法检测caspase通路相关蛋白(cleaved PARP、caspase-3、procaspase-9和caspase-8)的变化情况。结果: 土槿皮乙酸明显抑制脑胶质瘤U87细胞的活力，能使细胞阻滞于M期，并通过caspase通路诱导细胞发生凋亡。结论: 土槿皮乙酸能使脑胶质瘤细胞株U87细胞阻滞于M期，并诱导其凋亡。

脑胶质瘤； 土槿皮乙酸； 细胞周期； 细胞活力； 细胞凋亡

脑胶质瘤是中枢神经系统(central nervous system，CNS)常见的发生于神经外胚层的恶性肿瘤，占颅内肿瘤的40%左右[1-2]。脑胶质瘤传统的治疗方案包括外科手术、放疗和化疗。由于脑胶质瘤具有强侵袭性的特征，手术过程中很难与正常脑组织区分，因此手术后的辅助性化疗显得非常重要。目前临床上的一线化疗药物是替莫唑胺(temozolomide，TMZ)，该药由于其口服给药方便以及治疗效果较好，在脑胶质瘤化疗中占有重要的地位，然而其在用药过程中可产生极大的耐药复发问题及不良反应(如减少血小板及中性粒细胞、恶心、呕吐和倦怠等)[3-5]，大大地影响了该药治疗效果，用于治疗脑胶质瘤的新药研究迫在眉睫。

土槿皮乙酸(pseudolaric acid B，PAB)是从来源于松科植物金钱松的根皮和近根树皮的土槿皮提取的重要成分之一，分子式为C23H28O8[6]。土槿皮乙酸早期被人们用于抗真菌治疗，近年来越来越多的研究表明土槿皮乙酸能够有效杀伤包括人肝癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌及大鼠恶性胶质瘤等多种肿瘤细胞的同时却不损害正常细胞[6-7]。本研究以脑胶质瘤U87细胞株为研究模型，探讨土槿皮乙酸对其增殖和凋亡的影响，进而探讨土槿皮乙酸治疗脑胶质瘤的潜在应用价值。

材 料 和 方 法

1 材料

脑胶质瘤U87细胞由本实验室保存。DMEM培养基和胎牛血清为Gibco产品；土槿皮乙酸购自辰光生物有限公司；MTS试剂为Promega产品；碘化丙啶(propidium iodide，PI)购自BD。细胞凋亡双染(Annexin V/PI)检测试剂盒购自江苏凯基生物科技发展有限公司；p-histone(Ser10)H3抗体购自Signalway Antibody；抗caspase-8、procaspase-3、cleaved caspase-3及PARP的抗体为CST产品；抗procaspase-9、β-actin抗体和HRP标记的Ⅱ抗为Proteintech Group产品。

2 主要方法

2.1 细胞培养 U87细胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM于37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，实验所用的细胞均处于对数生长期。

2.2 细胞活力检测 用MTS法测细胞活力抑制情况，设空白对照组、对照组和实验组；取对数生长期的U87细胞接种于96孔板，对照组和实验组每孔接种100 μL细胞悬液，共5 000个细胞，空白对照组加入200 μL不含细胞的培养基，待细胞过夜贴壁后实验组每孔再加入100 μL含土槿皮乙酸培养基，使加入终浓度为0.1、1、10及100 μmol/L，对照组加入100 μL含血清的培养基，空白对照组不加，每组6个重复孔。不同剂量的土槿皮乙酸作用72 h后于实验各孔分别加MTS试剂40 μL，37 ℃继续孵育4 h，于酶联免疫检测仪测定490 nm处各孔的吸光度(A)值。细胞活力(%)=(A实验组-A空白对照组)/(A对照组-A空白对照组)，以浓度为横坐标，细胞活力为纵坐标绘制土槿皮乙酸对U87细胞生长活力抑制率柱状图。

2.3 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期细胞接种于6孔板，每孔接种2 mL细胞悬液，共5×105个细胞，待细胞过夜贴壁后实验组加入终浓度为0.5、1及2 μmol/L土槿皮乙酸，对照组不加药，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度细胞培养箱中培养，24 h后收集细胞并用75%乙醇于4 ℃固定过夜，过夜后离心去除固定液并用PBS清洗细胞2次，清洗后加入PI工作液500 μL，室温避光孵育15 min后于流式细胞仪进行细胞周期检测，细胞周期结果用BD FACSCanto II软件进行分析。

2.4 Annexin V/PI双标记法流式细胞术测定细胞凋亡 取对数生长期细胞接种于6孔板，每孔接种2 mL细胞悬液，共5×105个细胞，待细胞过夜贴壁后实验组加入终浓度为0.5、1及2 μmol/L土槿皮乙酸，对照组不加药，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养，72 h后收集细胞，经PBS清洗2次后加入500 μL binding buffer、5 μL Annexin V和5 μL PI。室温避光孵育15 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡。在双染流式细胞计数仪的散点图上，取右下象限和右上象限的总和(即Annexin V阳性细胞群)计为凋亡细胞。实验完全按照江苏凯基生物科技发展有限公司提供的试剂说明书进行操作，实验重复3次。

2.5 Western blot法检测蛋白水平 不同浓度的土槿皮乙酸处理U87细胞后收集细胞，PBS清洗细胞3次，然后加入蛋白裂解液充分裂解细胞提取蛋白,并用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。用10%～15% SDS聚丙烯酰胺凝胶将蛋白进行电泳(100～130 V恒压电泳约90 min)，蛋白分离后100 V恒压转膜约120 min，5%牛奶室温封闭膜1 h，用相应的Ⅰ抗4 ℃孵育膜过夜，次日将膜清洗后加入HRP标记的Ⅱ抗室温孵育1 h，洗涤后ECL发光液将膜显色，暗房曝光，使用ImageJ软件分析条带灰度值。

3 统计学处理

数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，用GraphPad Prism 6.01软件对数据进行单因素方差分析，均数间两两比较用Tukey检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PAB对U87细胞活力及细胞形态学的影响

PAB对U87细胞的生长有明显抑制作用，用不同浓度PAB处理U87细胞，并在不同时点对细胞进行观察拍照，当作用24 h时，1 μmol/L PAB可明显抑制U87的细胞生长，并使细胞出现由多边形变成圆形、发生空泡和胞膜破碎等具有死亡特征的形态学改变。随着时间的推进，在低浓度组也可出现该现象(未呈现)。PAB处理细胞72 h后用MTS法检测PAB对U87细胞活力的影响，结果显示PAB能够明显抑制U87细胞活力(P<0.05)，经计算，PAB对U87细胞活力半数抑制率IC50是1.76 μmol/L,见图1、2。

Figure 1.The effects of PAB on the morphological changes of U87 cells.

图1 PAB对U87细胞形态的影响

2 PAB能使U87细胞阻滞于M期

用不同浓度PAB处理细胞24 h，当PAB浓度达1 μmol/L时，U87的G2/M期的比例要明显高于对照组(图3)，其中对照组G2/M比例为24%，而1 μmol/L PAB处理组G2/M比例则增加至35.83%，说明PAB能使U87阻滞于G2/M期，而该比例随着PAB浓度的增加而增加，呈浓度依赖性。为了辨别清楚PAB阻滞U87于G2期还是M期，我们使用Western blot法检测经PAB处理后U87细胞中M期标志性蛋白p-histone H3的变化，结果如图4显示，与对照组相比，PAB处理后的U87细胞的p-histone H3明显上调(P<0.05)，说明PAB阻滞细胞于M期而非G2期。

Figure 2. The effects of PAB on the viability of U87 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L.

图2 PAB对U87细胞活力的影响

Figure 3. PAB induced G2/M phase arrest in the U87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

图3 PAB诱导U87阻滞于G2/M期

Figure 4. PAB up-regulated the protein levels of p-histone H3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

图4 PABs上调p-histone H3的蛋白表达水平

3 PAB对U87细胞凋亡的诱导

从图1和图3结果可以看出，随着处理浓度的增加，PAB能够诱导U87细胞死亡。为了探讨PAB是否诱导U87细胞发生凋亡，我们采用Annexin V/PI双染流式细胞术进行检测。经不同浓度PAB处理72 h后，当PAB浓度达1 μmol/L时U87细胞的凋亡率明显升高，其中对照组凋亡率为6.45%，而1 μmol/L PAB凋亡率则增加至25.55%，PAB诱导U87细胞凋亡作用呈剂量依赖性，表明PAB可以诱导U87细胞发生凋亡,见图5。

4 PAB通过caspase通路诱导U87细胞发生凋亡

如图6结果显示，用不同浓度PAB处理细胞72 h，当浓度达1 μmol/L时，caspase家族相关蛋白caspase-3、caspase-9和caspase-8前体减少，caspase-3和caspase-8出现切割带，且作为caspase的下游PARP也出现相应切割带，该结果的变化呈现PAB浓度依赖性。以上结果说明，PAB可能是通过caspase通路诱导U87细胞发生凋亡。

Figure 5.PAB induced the apoptosis of U87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

图5 PAB诱导U87细胞发生凋亡

Figure 6. The effects of PAB on the protein levels of apoptosis-related proteins cleaved PARP, caspase-3, procaspase-9 and caspase-8 in the U87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

图6 PAB对U87凋亡相关蛋白cleaved PARP、caspase-3、procaspase-9和caspase-8表达的影响

讨 论

本研究选取了脑胶质瘤细胞株U87为研究对象，探讨PAB对U87增殖和凋亡的作用及其相关分子学机制。实验结果表明，PAB能够抑制U87细胞的活力，使细胞阻滞于M期，并诱导细胞发生凋亡。

实验证实PAB能够明显抑制U87细胞活力；通过MTS法和镜下观察，我们可以发现随着PAB浓度的增加，U87细胞的生长抑制率明显增加。已有多篇文献报道PAB能够作用于肿瘤细胞微管蛋白，从而使细胞阻滞于M期[6,8-9]，为此，我们先用流式细胞术和Western blot法检测PAB对U87细胞周期的影响，结果显示PAB能够使细胞阻滞于M期从而抑制细胞增殖。镜下观察发现高浓度或长时间的PAB的处理能诱导细胞死亡，细胞周期结果显示高浓度PAB处理细胞时sub-G1的出现也证实了这一现象；细胞凋亡为药物诱导细胞死亡一种常见方式，也有多篇文献报道PAB使肿瘤细胞阻滞于M期后诱导细胞发生凋亡[10-11]。Annexin V/PI双标记流式细胞术检测结果显示PAB的确能诱导细胞发生凋亡，由于凋亡发生时间较晚，有可能是发生在细胞周期阻滞之后。另外，Western blot实验结果显示PAB能够使procaspase-3、procaspase-9和procaspase-8的表达下降，且呈浓度依赖性，另caspase-8、caspase-3和caspase-3的下游PARP也出现呈剂量依赖性的切割，表明PAB激活了caspase级联通路。上述结果说明，PAB能够抑制U87细胞活力，使细胞阻滞于M期，这可能与PAB作用于肿瘤M期细胞微管有关；由于肿瘤细胞增殖活跃，与正常细胞相比有更多的细胞处于M期，这也能部分解释为什么PAB在一定浓度下能作用于肿瘤细胞却不影响正常细胞，但是有关PAB对U87微管的作用本文并未涉及，仍需进一步探讨；在PAB的作用下，U87会发生凋亡，其发生机制可能是通过caspase通路进行，尽管PAB诱导细胞发生凋亡时间较诱导细胞发生周期阻滞时间晚，但本文并未有直接证据说明两者的前后关系，相关研究也需进一步进行；另外，目前PAB对各种肿瘤细胞均显示出了很好的抗肿瘤性，但是PAB的抗肿瘤分子机制仍不是很清楚，而PAB抗脑胶质瘤的确切分子机制也是未来需进一步探讨的课题。

总之，PAB能通过阻滞脑胶质瘤细胞于M期从而抑制细胞增殖，并诱导细胞发生凋亡，对脑胶质瘤具有重要的治疗前景。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Pseudolaric acid B induces glioblastoma cell line U87 mitotic arrest and apoptosis

HE Lu1, 4, WEN Chuang-yu3, WANG Hui-hui3, YANG Xiang-ling3,LIU Huan-liang2, 3, LI Zhong1, 4, 5

(1DepartmentofNeurology，2DepartmentofClinicalLaboratory，3GuangdongInstituteofGastroenterology,TheSixthAffi-liatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China;4GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBrainFunctionandDisease,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;5ShenzhenResearchInstituteofSunYat-senUnivesity,Shenzhen518057,China.E-mail:zslyjohn@163.com)

AIM: To investigate the effects of pseudolaric acid B on the growth and apoptosis of glioblastoma cell line U87. METHODS: The cell morphological changes were observed under inverted microscope. The cell viability was evaluated by MTS assay. The cell cycle was analyzed by flow cytometry and Western blot. The cell apoptosis was detected by flow cytometry. The changes of apoptosis-related proteins cleaved PARP, caspase-3, procaspase-9 and caspase-8 were determined by Western blot. RESULTS: Pseudolaric acid B inhibited the viability of U87 cells, arrested U87 cells in mitosis. Apoptosis of U87 cells was induced by pseudolaric acid B. The caspase pathway was activated. CONCLUSION: Pseudolaric acid B induces glioblastoma cell line U87 mitotic arrest and apoptosis.

Glioblastoma; Pseudolaric acid B; Cell cycle; Cell viability; Apoptosis

杂志网址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1574- 05

2016- 04- 05

2016- 05- 30

广东省自然科学基金资助项目(No. 2015A030313128)；广东省自然科学基金资助项目(No. 2014A030307025)；广州市天河区科技计划重点项目(No. 201404KW028)；深圳市科技计划项目(No. JCYJ20150403151851068)

R739.4; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.007