青藤碱关节腔注射对兔膝骨关节炎模型血清及滑液内脂素及抵抗素的影响

郑　洁　寇久社　王瑞辉

(陕西中医药大学针灸推拿学院，陕西　西安　712046)



青藤碱关节腔注射对兔膝骨关节炎模型血清及滑液内脂素及抵抗素的影响

郑洁寇久社1王瑞辉

(陕西中医药大学针灸推拿学院，陕西西安712046)

目的观察青藤碱关节腔注射对兔膝骨关节炎模型血清及滑液中脂肪因子内脂素及抵抗素含量的影响。方法38只新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、透明质酸钠组和青藤碱组。正常组不予任何处理，模型组、透明质酸钠组和青藤碱组通过木瓜蛋白酶关节腔注射法诱导膝骨关节炎模型后，分别用生理盐水、透明质酸钠和青藤碱干预，5 w后检测并比较各组血清及滑液中内脂素及抵抗素含量。结果各组间血清内脂素含量均无明显差异(P>0.05)；模型组滑液内脂素含量较其他各组明显升高(P<0.05)，青藤碱组较透明质酸钠组低(P<0.05)。模型组血清及滑液中抵抗素含量较其他各组均显著升高(P<0.05)，青藤碱组血清及滑液中抵抗素含量与透明质酸钠组比较无显著差异(P<0.05)。 结论青藤碱膝关节腔注射可降低兔膝骨关节炎模型滑液内脂素水平及血清、滑液中抵抗素水平。

青藤碱；关节腔内注射；骨关节炎；内脂素；抵抗素

骨关节炎(OA)是由多因素造成的关节退行性疾病，以关节软骨破坏、软骨下骨变化、骨赘形成以及滑膜炎症为主要特征。炎症在OA的发生发展过程中起到了不可忽视的作用，炎症可能是OA的原发事件，也可能是关节软骨生化变化的继发事件〔1〕。近年来发现，脂肪细胞因子除参与调节糖脂代谢，在炎症过程以及OA发病中均发挥了重要的调节作用〔2，3〕。青藤碱是从传统治疗风湿性疾病中药清风藤中提取的一种生物碱，具有镇痛、抗炎、调节免疫、降血压、抗心律失常等药理作用〔4〕。青藤碱在骨关节病中的临床及实验研究目前仍主要集中在类风湿性关节炎，而应用于OA的研究非常少。本实验拟探讨青藤碱治疗膝骨关节炎的部分作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组新西兰大白兔38只，雌雄各半，体重1.8～2.2 kg，由西安交大医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(陕)2008-008。适应性喂养1 w后，随机分为4组：正常组、模型组、透明质酸钠组和青藤碱组。其中正常组8只，其余各组均为10只。

1.2试剂与仪器内脂素及抵抗素试剂盒(北京诺博莱科技有限公司)，正清风痛宁注射液(湖南正清制药集团股份有限公司，批号1304402-003，规格2 ml∶50 mg)，玻璃酸钠注射液(山东博士伦福瑞达制药有限公司，批号130308011，规格2 ml∶20 mg)，木瓜蛋白酶(Merck公司，货号107147，活力6000 USP-U/mg)，Bio-Tec ELX808型酶标仪(美国Bio-Tec公司)，HH·W21·420型电热恒温水浴箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，KDC-40型低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)。

1.3方法

1.3.1模型制备造模方法采用木瓜蛋白酶关节腔注射法，分别于实验的第1、4、7天对造模组兔进行关节腔注射，首次注射4 w后兔右膝关节出现肿胀、跛行，表明造模成功。

1.3.2木瓜蛋白酶溶液配制将木瓜蛋白酶按4%(20 mg/0.5 ml)的浓度溶解于生理盐水中，装入50 ml 无菌瓶中并置于 0～4℃冰箱内保存备用。

1.3.3注射方法兔右膝关节备皮、75%乙醇消毒后，用左手从下方和两旁将右侧膝关节轻度屈曲位固定，右手持1 ml注射器在髌韧带附着点外上方约 0.5 cm 处向髁间窝方向进针，当出现落空感时表明已进入关节腔内，注入0.5 ml 4%木瓜蛋白酶水溶液。

1.3.4干预措施根据成人用药剂量(透明质酸钠和青藤碱均为2 ml/次)按Meeh-Rubner公式计算人兔等效剂量。除正常组外，对各组动物造模侧膝关节行关节腔注射，青藤碱组膝关节腔注射盐酸青藤碱注射液0.2 ml(5 mg)，1次/3 d，10次1个疗程，共给药10次；透明质酸钠组膝关节腔注射透明质酸钠注射液0.2 ml，1次/6 d，5次1个疗程，共5次；模型组膝关节腔注射生理盐水0.2 ml，注射次数同青藤碱组。共干预30 d。

1.3.5标本采集①血清采集：干预结束后，耳中动脉取血5 ml，4 000 r/min离心10 min，分离血清后-80℃冰箱保存备检。②滑液采集：干预结束后，生理盐水冲洗法收集滑液。于兔的右膝关节腔内注入生理盐水注射液1 ml(注射方法同前)，充分活动膝关节使生理盐水与关节滑液充分混合，再抽取关节腔生理盐水冲洗液0.6～1 ml至EP管，4 000 r/min离心10 min，取上清，-80℃保存备检。

1.3.6指标检测采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清和滑液中内脂素及抵抗素的含量。操作方法严格按照试剂盒说明进行。

1.4统计学处理采用SPSS19.0软件行单因素方差分析。

2　结　果

2.1肉眼观察实验过程中，模型组、透明质酸钠组及青藤碱组兔各死亡1只，各组实验兔最终为正常组8只，模型组、透明质酸钠组及青藤碱组各9只。正常组：滑膜未见明显改变，关节软骨表面呈浅蓝白色，光滑而有光泽，无糜烂。模型组：滑膜充血肿胀，关节软骨表面粗糙、肥厚，色泽变暗，伴有裂纹、糜烂，部分软骨下骨质暴露，滑液量多，色黄，质稠。透明质酸钠组：滑膜轻度肿胀，关节软骨表面欠光滑，部分可见裂纹，尚未见软骨下骨质暴露。青藤碱组：滑膜轻度肿胀，关节软骨略粗糙，糜烂程度较模型组轻。

2.2血清及滑液内脂素含量测定兔膝骨关节炎模型血清中内脂素含量无明显变化，正常组与其他各组血清内脂素含量比较均无显著差异(P>0.05)。模型组滑液内脂素含量较正常组、透明质酸钠组和青藤碱组均显著升高(P<0.05)，青藤碱组滑液内脂素含量与正常组比较无显著差异(P>0.05)，与透明质酸钠组比较呈显著差异(P<0.05)，见表1。

表1　各组兔血清及滑液内脂素含量比较±s,μg/L)

与模型组比较:1)P<0.05；与透明质酸钠组比较比较:2)P<0.05

2.3血清及滑液抵抗素含量测定模型组血清及滑液中抵抗素含量较正常组、透明质酸钠组和青藤碱组均显著升高(P<0.05)，青藤碱组血清及滑液中抵抗素含量与正常组比较有显著差异(P<0.05)，与透明质酸钠组比较无显著差异(P>0.05)，见表2。

表2　各组兔血清及滑液抵抗素含量比较±s,μg/L)

与正常组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05

3　讨　论

脂肪细胞因子是一类由白色脂肪组织分泌的内源性活性多肽，在OA病理生理过程中发挥了重要作用，既可作为前炎(或促炎)细胞因子参与OA炎症过程；也可独立地或与一些炎性因子协同作用，通过软骨基质降解酶加速OA后期软骨蜕变过程〔3〕。内脂素最早发现于肝脏、骨髓和肌肉，后来发现内脏脂肪组织也可分泌内脂素。OA患者髌下脂肪垫和滑液中内脂素含量均显著增高〔5，6〕，且滑液中内脂素水平与软骨降解产物Ⅱ型胶原和蛋白聚糖含量呈正相关，表明内脂素参与OA软骨基质的降解过程〔6〕。抵抗素在多种炎症性疾病的发病中起到了重要的调控作用。创伤性关节炎患者血清和滑液抵抗素的含量均明显提高〔7〕。经抵抗素诱导后，人软骨细胞中多种趋化因子和细胞因子的基因表达均上调，证实抵抗素可能作为致炎因素参与了OA炎症反应，并加速了软骨的降解过程〔8〕。本实验发现，木瓜蛋白酶诱导兔膝骨关节炎模型滑液中内脂素和血清及滑液抵抗素水平均显著提高，进一步证实内脂素和抵抗素等脂肪因子参与OA病理过程。临床研究表明，青藤碱可缓解OA患者膝关节疼痛、肿胀及晨僵等症状，显著改善膝关节功能障碍〔9，10〕。青藤碱膝关节腔注射后，关节腔滑液中TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量显著下降〔11～13〕，提示青藤碱对OA软骨具有保护作用，其机制可能与其抗炎作用有关。本实验结果表明青藤碱关节腔注射抗OA作用可能与影响内脂素和抵抗素等脂肪因子水平密切相关。

1Rainbow R，Ren WP，Zeng L.Inflammation and joint tissue interactions in OA：implications for potential therapeutic approaches〔J〕.Arthritis，2012;2012：741582.

2Gualillo O，Gonz′alez-Juanatey JR，Lago F，etal.The emerging role of adipokines as mediators of cardiovascular function：physiologic and clinical perspectives〔J〕.Trends Cardiovasc Med，2007;17(8)：275-83.

3Conde J，Scotece M，Gomez R，etal.Adipokines and osteoarthritis：novel molecules involved in the pathogenesis and progression of disease〔J〕.Arthritis，2011;2011：203901.

4季宇彬.中药有效成分药理与应用〔M〕.哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1995:427.

5Duan Y，Hao D，Li M，etal.Increased synovial fluid visfatin is positively linked to cartilage degradation biomarkers in osteoarthritis〔J〕.Rheumatol Int，2012;32(4)：985-90.

6Klein-Wieringa IR，Kloppenburg M，Bastiaansen-Jenniskens YM，etal.The inflapatellar fat pad of patients with osteoarthritis has an inflammatory phenotype〔J〕.Ann Rheum Dis，2011;70(5)：851-7.

7Lee JH，Ort T，Ma K，etal.Resistin is elevated following traumatic joint injury and causes matrix degradation and release of inflammatory cytokines from articular cartilage in vitro〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2009;17(5)：613-20.

8Zhang Z，Xing X，Hensley G，etal.Resistin induces expression of proinflammatory cytokines and chemokines in human articular chondrocytes via transcription and messenger RNA stabilization〔J〕.Arthritis Rheum，2010;62(7)：1993-2003.

9白玉龙，许红英，杨晓冰.盐酸青藤碱改善膝骨关节炎患者运动功能36例〔J〕.中国临床康复，2002;6(27)：3731-5.

10谭志明，李久峰.正清风痛宁和塞来昔布改善骨性关节炎功能障碍的效果分析〔J〕.中国临床康复，2002;6(14)：2132-3.

11杨惠琴，陈礼荣.青藤碱对膝骨性关节炎实验兔关节液及血清白细胞介素-1β 含量的影响〔J〕.中西医结合学报，2008;6(12)：1275-9.

12杨惠琴，陈礼荣.青藤碱对膝骨性关节炎实验兔关节液及血清中TNF-α 水平的影响〔J〕.中华物理医学与康复杂志，2008;30(7)：448-50.

13吴红娟，孙必强，朱传湘，等.盐酸青藤碱对家兔骨关节炎关节液IL-1β、PGE2 生成与关节组织结构的影响〔J〕.湖南中医药大学学报，2010;30(9)：84-6.

〔2014-12-09修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

陕西省中医康复学重点学科建设项目(陕中医药发〔2011〕46号)；陕西省教育厅科学研究项目(14JK1209)

郑洁(1978-)，女，副教授，博士，主要从事骨关节及骨代谢性疾病的中医康复研究。

R285

A

1005-9202(2016)16-3904-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.015

1陕西中医药大学第二附属医院