表皮角质细胞与血管内皮细胞共培养对血管内皮生长因子水平的影响

张　燕　王　涛　刘桂丽　李瑞静　高顺强　王文氢　程　毅

(河北医科大学第四医院皮肤科，河北　石家庄　050011)



表皮角质细胞与血管内皮细胞共培养对血管内皮生长因子水平的影响

张燕王涛1刘桂丽李瑞静高顺强王文氢程毅

(河北医科大学第四医院皮肤科，河北石家庄050011)

目的探讨人表皮角质细胞与血管内皮细胞共同培养对血管内皮生长因子(VEGF)作用的机制。方法购制人表皮角质细胞和血管内皮细胞进行体外培养，采用双腔通透性测定试剂盒建立细胞共培养模型，应用浓度为15 ng/ml的重组人血管内皮生长因子(VEGF)121和VEGF165作为对照组。利用荧光酶标仪测定不同时间段FITC-dextran量变化，观察血管内皮细胞单层通透性的改变。采用Griess法测定血管内皮细胞产生氧化氮(NO)的变化。结果共培养模型中，血管内皮细胞、表皮角质细胞生长良好，以连续单层形式存在；内池中VEGF121水平在5、30 min、1、2、3、4、5、6 h显著高于VEGF165 (P<0.05)；在0、1、5、10 min，共培养模型内池中NO的含量低于VEGF121刺激组(P<0.05)，但高于VEGF165刺激组(P<0.05)。结论(1)表皮角质细胞分泌VEGF有时间依赖性，其中VEGF121含量较VEGF偏多。(2)表皮角质细胞分泌物可诱导NO产生，其能力介于VEGF121和VEGF165，因此考虑表皮角质细胞分泌物中引起NO产生增加的主要成分为VEGF。(3)表皮角质细胞分泌物可引起血管内皮通透性增加，其能力介于VEGF121和VEGF165，且数值接近于VEGF121，因此考虑表皮角质细胞分泌物中VEGF121较VEGF165含量高，且VEGF121较VEGF165引起血管通透性能力强。

表皮角质细胞；血管内皮细胞；血管内皮生长因子

目前人类已经发现的皮肤病约有2 000余种，且多数发病机制尚不完全明了，也无理想的治疗方法〔1〕。特应性皮炎患者在急性期以红斑、渗出为主要表现，其病理表现是真皮乳头层毛细血管网扩张而产生的红色斑疹，进而持续扩张导致血管通透性增高而出现真皮浮肿，其原因考虑是该类患者表皮中血管内皮生长因子(VEGF)121较VEGF165含量明显增高所造成的〔2〕。但其具体发病机制需要进一步的研究去阐明。

VEGF在表皮主要由角质形成细胞(KC)分泌，目前研究最多的亚型包括VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189等。特异性皮炎时，皮肤KC能够分泌更多的VEGF，从而促进真皮层微血管增生〔3〕。本文拟研究人表皮细胞产生的VEGF对血管内皮细胞的作用机制，进而探讨特应性皮炎的可能发病机制。

1　对象与方法

1.1主要仪器和试剂人脐静脉内皮细胞、人表皮角质细胞，美国Invitrogen公司；角化细胞生长培养基(KGM-2)、内皮细胞生长培养基(EGM-2)，美国Lonza公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料公司；重组人VEGF121和 VEGF165抗体，美国Minneapolis公司；十二水磷酸氢二钠，天津市化学试剂厂；CO2恒温培养箱，美国Sheldon公司；倒置显微镜，日本Nikon公司；多功能酶标仪(SynergyⅡ)，美国biotek公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养分别将1 ml冻存的人脐静脉内皮细胞、人表皮角质细胞直接浸泡在37℃温水中轻轻摇动，让细胞充分融化。从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，采用吸管将细胞悬液吸出，向离心管中加入10倍以上的培养液，充分混合均匀，1 000 r/min离心5 min。去除上清液，分别加入EGM-2 及KGM培养基，重悬细胞，调整细胞密度，并将其分别接种在培养瓶中，放入37℃、5%CO2培养箱中进行培养，隔日换液一次，待细胞融合85%后进行传代培养。传代细胞的密度控制在不低于5×105/ml，以免影响传代细胞的生长。待细胞再次融合为85%后冻存备用。

1.2.2共培养模型的建立应用双腔通透性测定试剂盒，检测单层血管内皮细胞在表皮角质细胞分泌的物质作用下通透性的变化。双腔通透性测定试剂盒主要由内池和外池构成，内池底部为多聚碳酸脂膜的培养碟，直径0.8 μm，外池为普通培养碟。向内池加入200 μl胶原蛋白，孵育1 h，保证溶液能完全覆盖底部且没有气泡，去除胶原蛋白，加入磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗1次，将培养的人脐静脉内皮细胞加入EGM-2完全培养液。向外池内加入人表皮角质细胞，并加入KGM-2完全培养液。将以上两种细胞放入37℃、5%CO2培养箱中分别培养，观察两种细胞生长情况。当血管内皮细胞形成完整的单层结构，将内外池组合，构建人脐静脉内皮细胞、表皮角质细胞共培养的体外模型。

1.2.3实验组与对照组设计将共培养模型内池更换为EGM-2去生长因子培养液，外池更换为去生长因子KGM-2培养液。采用人重组VEGF121和VEGF165作为对照，浓度15 ng/ml。与实验组不同之处为外池无培养侧表皮胶质细胞，内池的实验溶液中分别加入VEGF121和VEGF165。将以上实验组及对照组组合完成后放置在37℃、5%CO2培养箱中培养，备用。

1.2.4一氧化氮(NO)测定根据NO稳定的最终代谢产物亚硝酸盐在酸性环境中与 Griess 试剂中的氨基苯碘酸等物质进行反应，产生鲜橙红色产物，在545 nm下确定最大光吸收，颜色越深，表示NO含量越高。分别于0、1、5、10 min对内池中NO含量进行测定。

1.2.5观察指标(1)人血管内皮细胞及表皮角质细胞在共培养模型中的形态；(2)共培养模型内池中VEGF121和VEGF165在5、30 min、1、2、3、4、5、6 h的水平；(3)5、30 min、1、2、3、4、5、6 h共培养模型中血管内皮细胞单层通透性的变化；(4)共培养模型内池中NO在0、1、5、10 min的水平。

1.3统计学方法应用SPSS18.0软件行t检验。

2　结　果

2.1共培养模型中血管内皮细胞及表皮角质细胞生长状态两种细胞生长良好。形态观察：获得的内皮细胞、表皮角质细胞以连续单层形式存在于血管内腔表面，形态扁平、略长、多角形为主，细胞排列比较紧密。见图1。

2.2血管内皮细胞、表皮角质细胞VEGF121和VEGF165水平比较各时间段血管内皮细胞以及表皮角质细胞中VEGF121水平均显著高于VEGF165(P<0.05)。见表1。

2.3共培养模型内池中NO含量的检测在0、1、5、10 min，共培养模型内池中NO的含量低于VEGF121刺激组(P<0.05)，但高于VEGF165刺激组(P<0.05)。见表2。

2.4表皮角质细胞分泌物对血管内皮通透性的影响表皮角质细胞分泌物可引起血管内皮通透性增加，其能力介于VEGF121和VEGF165，且数值接近于VEGF121，因此考虑表皮角质细胞分泌物中VEGF121较VEGF165含量高，且VEGF121较VEGF165引起血管通透性能力强(P<0.05)。见表3。

图1　血管内皮细胞、表皮角质细胞形态观察(×200)

指标5min30min1h2h3h4h5h6hVEGF1210.785±0.0245.217±0.47311.931±0.22623.987±0.07433.787±0.77146.346±0.65056.244±0.23271.207±0.496VEGF1650.625±0.0283.603±0.1047.503±0.12315.138±0.19620.843±0.35127.234±0.29929.932±0.93046.742±0.613t/P值19.53/<0.0520.44/<0.0517.42/<0.0522.04/<0.0519.53/<0.0520.44/<0.0517.42/<0.0522.04/<0.05

表2　共培养模型内池中NO含量的检测±s)

与共培养组比较：1)P<0.05,2)P<0.01;下表同

表3　表皮角质细胞分泌物对血管内皮通透性的影响±s)

3　讨　论

皮肤病是一种常见的容易复发的慢性炎症性疾病，患者发病后临床症状显著，如果不采取积极有效的治疗方法，将会对患者身体健康产生较大影响〔4〕。微血管是皮肤组织与循环血液进行交换的场所，组织增生超过正常血管供应范围时将会引起组织缺氧、抑制组织增生。文献报道显示〔5〕：血管生成属于一种比较复杂的过程，涵盖了血管内皮细胞的激活、降解、增殖等。因此，研究表皮角质细胞与血管内皮细胞培养VEGF具有重要的意义。

VEGF具有良好的生物学特性，能增加血管通透性，对血管内皮细胞具有特异性〔6〕。相关研究显示〔7〕：正常人皮肤中含有较高的VEGF，能维持机体微血管密度，从而能够保持血管的通透性。VEGF的调节相对复杂，缺氧能强烈诱导VEGF的表达。缺氧首先诱导VEGF mRNA转录，再由VEGF启动子位点的转录子缺氧诱导因子介导VEGF表达。

表皮角质细胞与血管内皮细胞均属于一类特殊的细胞，具备良好的生物特性，能够在特定的环境下参与血液、组织之间的营养交换。同时，表皮角质细胞与血管内皮细胞能在血管的形成、血管动力学等方面发挥作用。通常情况下，表皮角质细胞与血管内皮细胞以单层、连续方式存在，形态以扁平、略长、多角形为主，细胞排列比较紧密。同时，表皮角质细胞与血管内皮细胞之间具有一定的黏附性，能紧密连接和缝隙连接。血管内皮细胞是血管、血管壁的屏障，由于内皮细胞具有良好的通透性，能直接参与细胞的血液传递、运动调节，参与机体炎症反应，影响血管的发生、血管通透性和液体的平衡等〔8〕。

在皮肤病患者中，皮损区VEGF水平高于非皮损区及正常皮肤，并且患者病情越严重，VEGF水平越高。VEGF在特应性皮炎患者体内生物学特点相对活跃：(1)VEGF能够提高血管细胞的通透性；(2)VEGF能与表皮角质细胞、血管内皮细胞结合，促进细胞发生裂解，促进血管生成。本研究中，在不同时间段，血管内皮细胞、表皮角质细胞VEGF121和VEGF165水平均呈现上升趋势，但是VEGF121水平上升幅度显著高于VEGF165。

NO功能相对较多，如神经传导功能、抑制血小板聚集、松弛血管平滑肌以及细胞毒性及免疫功能，增加血管通透性，提高血管舒张压，为机体提供血量。VEGFR-2能够介导生成NO和前列腺素，使血管平滑肌得到松弛。

综上，表皮角质细胞与血管内皮细胞共同培养后VEGF121和 VEGF165水平均明显升高，可以引起血管内皮细胞通透性增加，进一步刺激产生NO。但是，VEGF121对通透性的影响明显高于 VEGF165，具有较高的临床应用价值。

1蒋建华，多兰.新疆地区维吾尔族寻常型银屑病与HLA-DRB1 07等位基因的关联研究〔J〕.医学研究生学报，2012；25(1)：54-7.

2Miyoshi K,Takaishi M,Nakajima K，etal.Stat3 as a therapeutic target for the treatment of psoriasis：a clinical feasibility study with STA-21，a Stat3 inhibitor〔J〕.Invest Dermatol，2011；131(1)：108-17.

3Nast A，Boehncke WH，Mrowietz U，etal.S3-Guidelines on the treatment of psoriasis vulgaris (English version).Update〔J〕.J Dtsch Dermatol Ges，2012；10(2)：S1-95.

4杨斌，邓立欢，李秉航，等.角质细胞生长因子及氯化锂诱导毛囊干细胞定向分化中的信号通路〔J〕.中国组织工程研究，2014；18(19)：3060-8.

5Johnston A，Xing X，Guzman AM，etal.IL-1F5，-F6，-F8，and-F9：a novel IL-1 family signaling system that is active in psoriasis and promotes keratinocyte antimicrobial peptide expression〔J〕.J Immunol，2011；186( 4)：2613-22.

6刘瑞风，尹国华，张静，等.寻常型银屑病患者骨髓间充质干细胞生物学特性研究〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志，2010；30(3)：238.

7龙庭凤，何黎，刘流，等.人日光性角化病角质形成细胞的体外培养〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2010；14(20)：3660-5.

8Guo A，Jahoda CA.An improved method of human keratinocyte culture from skin explants：cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells〔J〕.Exp Dermatol，2009；18(8)：720-6.

〔2016-03-28修回〕

(编辑袁左鸣)

国家自然科学基金青年基金项目(81101179)

张燕(1975-)，女，副教授，副主任医师，主要从事皮肤科基础研究。

R392.12

A

1005-9202(2016)16-3885-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.007

1河北省人民医院肾内科