胶质瘤干细胞的内皮分化和管腔形成能力

展　涛　陈丽丽　颜　彬　曹　永　马志红　岳　辉

(牡丹江医学院，黑龙江　牡丹江　157011)



胶质瘤干细胞的内皮分化和管腔形成能力

展涛陈丽丽颜彬曹永马志红岳辉

(牡丹江医学院，黑龙江牡丹江157011)

目的探讨胶质瘤干细胞内皮分化和形成管腔的能力。方法以含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养U87人脑胶质母细胞瘤细胞，再用免疫磁珠法结合“悬浮克隆球形成法”分离胶质瘤干细胞，先行形态学观察，然后采用免疫荧光方法检测CD133、Nestin和GFAP表达，鉴定胶质瘤干细胞。将分离所得的胶质瘤干细胞在添加20 μg/ml血管内皮生长因子(VEGF)，1 μg/ml FGF和2 μg/ml胰岛素样生长因子(IGF)的10% DMEM培养基中诱导培养，分别取培养3 d和7 d的细胞进行Western印迹检测内皮特定蛋白的表达。同时将诱导培养7 d的细胞接种于涂有Matrigel的24孔板中，12 h和24 h后于倒置显微镜下观察并采集图像。结果免疫磁珠法结合“悬浮克隆球形成法”分离出的胶质瘤细胞团呈现明显的CD133和Nestin免疫荧光染色，但GFAP未显示荧光染色；Western印迹检测发现被诱导的胶质瘤干细胞随着时间延长，CD133的表达逐渐减弱直至消失，而CD31和 vWF表达由弱到强；Matrigel 结果显示被诱导7 d的胶质瘤干细胞明显形成了完整的管腔。结论胶质瘤干细胞在内皮细胞生长条件下，可以分化为内皮样细胞并且具有形成管腔的能力。

胶质瘤干细胞；内皮细胞；血管形成；胶质瘤

胶质瘤是最常见和死亡率最高的颅脑原发性恶性肿瘤，占脑肿瘤的大部分，而胶质瘤的发展及治疗与肿瘤中血管形成密切相关〔1〕。近年来又发现了一种与传统肿瘤血管生长途径完全不同的、不依赖内皮细胞的全新血液供应方式，即血管生成拟态(VM)〔2〕。因此，研究胶质瘤干细胞的内皮分化和形成管腔能力对于开展胶质瘤临床新疗法有着重要的意义。

1　材料与方法

1.1肿瘤细胞系及培养选用人U87人脑胶质瘤细胞作为研究对象，细胞系由牡丹江医学院病理教研室惠赠。将细胞置于37℃，5%CO2的培养箱中，用含10%胎牛血清、青霉素100 IU/ml、链霉素50 IU/ml的DMEM培养基培养。

1.2用免疫磁珠方法分离胶质瘤干细胞参照齐玲等〔3〕报道，用免疫磁珠方法分离脑肿瘤干细胞，分离出胶质瘤干细胞，并将其接种到含内皮生长因子(EGF，20 μg/ml)，bFGF(20 μg/ml)，B27添加剂(1×)的无血清培养基中，平稳置入5%CO237℃湿度条件饱和的培养箱中培养。72 h后显微镜下观察干细胞球形成情况并采集图像。

1.3免疫荧光法鉴定胶质瘤干细胞取培养至第5天的细胞球悬液用移液枪移至离心管中，1 000 r/min，离心5～10 min，用移液枪移除上清液，以含10%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，之后采用免疫荧光法进行鉴定，实验中设立空白对照组和阴性对照组(CD133-细胞)，荧光显微镜下观察结果并采集图像。

1.4胶质瘤干细胞的诱导培养胶质瘤干细胞被培养7 d后分为对照组及诱导组。对照组仅给10%胎牛血清的DMEM培养基；诱导组在10%胎牛血清的DMEM培养基中分别添加20 μg/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF)，1 μg/ml FGF和2 μg/ml胰岛素样生长因子(IGF)。培养期间每2～3 d换液并补充相应生长因子。

1.5Western印迹检测被诱导的胶质瘤干细胞内皮标记物的表达取被诱导3 d和7 d的胶质瘤干细胞加入200 μl细胞裂解缓冲液〔100 mmol/L Tris/HCl，100 mmol/L氯化钠，0.5%脱氧胆酸钠，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1%NP40，0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶抑制剂〕，提取内皮祖细胞(EPCs)的总蛋白并经 Lowrry法定量；取40 μg蛋白上样到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳(100 V，1.5 h)，待溴酚蓝进入凝胶底部后，把蛋白质再印迹到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用抗CD133、CD31和血管性假血友病因子(vWF)抗体(1∶200)和抗β-actin(1∶500) 抗体孵育，最后加入用碱性磷酸酶(AP)标记的相应二抗，用 o-Dianisidine，tetrazotized 和β-naphthyl acid phosphate 显色剂显色后用凝胶成像仪分析图像。

1.6被诱导的胶质瘤干细胞体外管腔形成能力的检测将Matrigel均匀滴涂于24孔板里，送培养箱里凝固30 min；取被诱导7 d的胶质瘤干细胞经胰酶消化制备成单细胞悬液，计数并调节细胞密度为 6×104个细胞/ml；按 0.5 ml/孔的量接种细胞悬液于Matrigel胶表面，培养24～48 h；显微镜观察管腔样结构形成情况，拍照，计数。

1.7统计学方法应用SPSS20.0软件，组间资料比较采用ANOVA和t检验。

2　结　果

2.1胶质瘤细胞系免疫磁珠分选前镜下观察U87细胞培养1 d后，大部分细胞贴壁，有梭形、星形等多种形态。培养3～5 d后细胞突起逐渐增多，细胞融合达70%～80%。见图1。

图1　U87细胞培养3 d后镜下观察

2.2免疫磁珠分选后的细胞生长状况和形态学观察U87细胞用CD133+磁珠分选后再用含bFGF+EGF+B27的无血清DMEM/F12培养液悬浮细胞，结果与未分选而直接进行培养的U87细胞相比，磁珠分选系统分离后的细胞接种后1～2 d内细胞生长比较缓慢，几无明显增殖，培养第3天可见一些悬浮细胞形成多个细胞的圆形克隆；第5～7天可见大量悬浮生长的由几十个到几百个圆球形细胞组成的细胞球。细胞形态均一，结合紧密，折光性好。吹打成单细胞悬液，经过传代培养可形成许多新的细胞球。见图2。

2.3免疫荧光鉴定胶质瘤干细胞免疫荧光染色发现：4 h后贴壁的细胞团呈明显的CD133和Nestin荧光染色，但GFAP未显示荧光染色。阴性对照组也未显示荧光染色。胶质瘤干细胞核用DAPI(蓝色)标记。见图3。

图2　免疫磁珠分选结合无血清培养后胶质瘤细胞生长情况

A：CD133阳性细胞示红色荧光；B：Nestin阳性细胞示绿色荧光；C：双重染色阳性的细胞示黄色荧光，即胶质瘤干细胞；D：A、B、C 图 DAPI 细胞核染色；E：阴性对照组细胞DAPI 细胞核染色；F：阴性对照组细胞PE染色；G：阴性对照组细胞FITC染色；H：GFAP染色未显示荧光图3　磁珠分选结合悬浮克隆球培养分离的胶质瘤干细胞CD133、Nestin和GFAP表达(×100)

2.4诱导培养的胶质瘤干细胞形成管腔的能力接种于Matrigel上的细胞，未诱导的细胞未见明显细胞条索形成，而被诱导的细胞在12 h后开始往凝胶里爬行生长，呈明显条索；24 h后这些条索互相开始链接，融合成类似圆形、三角形和多边形的管腔样结构。见图4。

2.5胶质瘤干细胞诱导分化后内皮分化相关蛋白的表达Western印迹研究发现：当细胞被诱导到第3天时，仍然有CD133表达，CD31和 vWF有微弱表达；但到第7天时，CD133的表达消失，说明被诱导的细胞已经失去干/祖细胞的标记，而CD31和 vWF的表达明显增强(P<0.05或P<0.01)。见图5。

图4　胶质瘤干细胞在Matrigel上形成管腔情况(×100)

与对照组(0 d)比较:1)P<0.01；组内与3 d比较:2)P<0.01，3)P<0.05图5　Western印迹检测胶质瘤干细胞诱导分化后CD133、CD31和 vWF表达

3　讨　论

肿瘤内在新生血管时，参与其中的内皮细胞主要来源于：①肿瘤细胞以趋化的方式募集原有血管内皮细胞，通过出芽、运动和迁移进入肿瘤组织当中；②血液循环中祖细胞(EPC)定位和分化，从而产生新的血管内皮。

以往研究胶质瘤干细胞在胶质瘤血管生成过程中的作用主要是集中在分析胶质瘤干细胞如何通过分泌促血管形成因子来刺激血管形成，而在本研究中则是分析胶质瘤干细胞能否直接分化为内皮细胞并具有管腔形成的能力。目前分离肿瘤干细胞(TSCs)的主要方法为荧光激活细胞分选术和磁性激活细胞分选术。也有研究者根据干细胞高表达ATP结合盒超家族(ABC)转运体的特点，通过流式细胞仪从胶质瘤细胞系内分离出侧群干细胞(SP细胞)，并证实这类细胞具有 TSCs 特性〔4〕。流式细胞技术分选细胞对细胞损伤较大，而且容易受到污染，不易控制。免疫磁珠分选技术利用包被有单克隆抗体的纳米级球形磁性微粒特异性地与靶物质相结合，使之具有磁响应性，应用外部建立的磁场，分离出具有活性的靶细胞。本实验以免疫磁珠分选法，利用胶质瘤干细胞表面具有干细胞特有的表面标志物 CD133 的特点〔5〕，选用 CD133 抗体包被的免疫磁珠，从人胶质母细胞瘤悬液中有效地分离只占肿瘤细胞总数 0.1%～1%的TSCs。进一步利用公认的神经干细胞标记物CD133、Nestin同时阳性表达和神经胶质细胞特异性GFAP阴性表达作为判断胶质瘤干细胞的标准，结果成功获得了胶质瘤干细胞，同时也为继续研究其能否被诱导成具有内皮标记的细胞和参与管腔形成奠定了基础。

干细胞在分子水平，通过细胞-细胞间、细胞-间质及各种分子的相互作用，使一些关键基因表达发生改变，产生特异的蛋白质，从而调整其分化，导致细胞结构与功能等方面发生变化，造成表型出现变化。在本实验中，通过其形态学变化，表明胶质瘤干细胞已经从形态学接近了内皮细胞。

本研究显示，胶质瘤干细胞在内皮条件下培养到第3天时，仍然有CD133的表达，而CD31和 vWF开始有较弱的表达；但到第7天时，CD133的表达消失，说明被诱导的细胞已经失去干/祖细胞的标记，而CD31和 vWF的表达明显增强。这也说明随着细胞被诱导时间延长，其内皮特定蛋白的表达也逐渐增加且趋于稳定；同时也表明胶质瘤干细胞在内皮环境下完全可以被诱导成内皮样的细胞。将经过内皮诱导7 d的胶质瘤干细胞接种于Matrigel上，结果表明，胶质瘤干细胞在内皮培养基中不但可以分化为内皮样细胞，而且从功能上也具备了形成管腔的能力，据此也可以推断这种胶质瘤干细胞在体内环境适宜的情况下也可能通过内皮分化而直接参与肿瘤血管的形成。但是，胶质瘤干细胞在体内如何参与血管形成，胶质瘤干细胞又如何向内皮细胞转化，转化过程中涉及了哪些信号转导通路，这都还有待于进一步研究。

1杨世强，李蕴潜.CD105与人脑胶质瘤肿瘤血管生成关系的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(12)：3504-6.

2Maniotis AJ，Folberg R，Hess A，etal.Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro：vasculogenic mimicry 〔J〕.Am J Pathol，1999；155(3)：739-52.

3齐玲，金宏，丁丽娟，等.CD133免疫磁珠分选脑肿瘤干细胞及其生物学特性〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2011；37(3)：441-4，572.

4Kondo T，Setoguchi T，Taga T.Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cell in the C6 glioma call line〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2004;101(3):781-6.

5Holland EC.Glioblastoma multiforme：the terminator〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2000；97(12)：6242-4.

〔2015-11-29修回〕

(编辑袁左鸣)

黑龙江省教育厅科研项目(No.12541849)

陈丽丽(1979-)，女，主治医师，主要从事临床医学研究。

展涛(1981-)，男，硕士，讲师，主要从事病理学研究。

R739.4

A

1005-9202(2016)16-3910-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.018