鹿角胶对脑缺血大鼠脑组织的保护作用及机制

李　辉　陈俊宇　杨　擎　张慧媛　林嘉楠　刘英娜　黄连弟　黄　迪　李俊玮　赵本正　李　娜

(吉林省前卫医院，吉林　长春　130012)



鹿角胶对脑缺血大鼠脑组织的保护作用及机制

李辉陈俊宇1杨擎2张慧媛2林嘉楠2刘英娜2黄连弟1黄迪1李俊玮1赵本正1李娜2

(吉林省前卫医院，吉林长春130012)

目的观察鹿角胶对大鼠脑缺血损伤的保护作用，并探讨其作用机制。方法40只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、低剂量组和高剂量组。线栓法制备大鼠脑缺血模型。采用行为学评分评价大鼠脑缺血程度，大脑TTC染色观察梗死面积，HE染色观察组织结构变化，比色法检测大鼠血清中相关过氧化物水平。结果与模型组比较，鹿角胶给药组脑缺血程度明显减轻，梗死面积减小，神经元胞体肿胀减轻，乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平下降(P<0.05)，总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)及过氧化氢酶(CAT)的活力增强。结论局部脑缺血导致脑梗死过程中，鹿角胶可通过清除脑组织缺血损伤过程中产生的氧自由基，进而达到保护脑组织的目的。

脑缺血；鹿角胶；氧化损伤

脑血管疾病中，缺血性脑血管病占80%以上，大脑中动脉闭塞(MCAO)占血管闭塞的43%。因此，针对MCAO的研究显得尤为重要〔1〕。脑血管发生部分或者全部阻塞后，导致相应供应区的脑组织供血不足，脑细胞缺血缺氧产生大量氧自由基，导致细胞发生氧化应激损伤〔2〕。鹿角胶由鹿科动物梅花鹿(Cevus Nippon Temininck)或马鹿(C.ela Phus L)的角煎熬而成，始载于《神农本草经》，称“白胶”，在《本草逢原》中称鹿胶，现称鹿角胶。中医医书中记载鹿角胶针对消肿、益肾、治疮疡肿毒、痕血作痛、虚劳内伤、腰脊疼痛等具有很好的疗效〔3〕。现代医学报道，鹿角胶成分多样，包含胶质25%、磷酸钙50%～60%以及少量雌酮，另含有多种氨基酸，包括色氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸等，还含有硫酸软骨素A、激素、胆碱样物质及多种微量元素〔4〕。鹿角胶所含物质的多样性决定了其对人体具有广泛的药用价值，据文献报道，中医涉及鹿茸的方剂有852个，统计相关文献结果显示，其主要功效包括壮肾阳、益精血、强筋骨、驻颜悦色、益气养神等〔5〕，而鹿角胶对脑缺血再灌注损伤的作用仍需进一步研究。

1　材料与方法

1.1主要试剂鹿角胶(河南辅仁堂制药有限公司，批注文号：国药准字Z41021998)；乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量，总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)活力检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.2动物分组及模型制备将40只大鼠分为：①空白组，通过灌胃法给等量的盐水；②模型组，用线栓法阻断左侧颈总动脉，制备大鼠MCAO脑缺血模型；③鹿角胶低剂量组，造模前1 w灌胃给予大鼠鹿角胶溶液0.3 g/kg，1次/d，1次/d，之后再进行造模，简称低剂量组；④鹿角胶高剂量组，造模前1 w灌胃给予大鼠鹿角胶溶液0.6 g/kg，之后再进行造模，简称高剂量组。

参照文献〔6〕方法制备大鼠局灶性脑缺血模型。用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠固定于手术台上，切开右侧颈部皮肤分离并结扎颈外动脉，自右侧颈总动脉剪口将3 cm的尼龙线(末端烧成圆形，直径约0.25 mm)自切口插入，进入颈内动脉约18 mm直至有轻微阻力为止，固定尼龙线并缝合皮肤。术后 37℃保温，待动物苏醒后通过神经功能学评分判定模型是否制备成功。

神经功能学评分的标准〔7〕：0分，无神经功能缺失症状；1分，提尾时损伤对侧前肢屈曲；2分，前肢屈曲对侧抵抗推力下降；3分，向对侧转圈；4分，向对侧转圈及意识障碍。评分在 2 分以上为造模成功。

1.3形态学观察模型制备成功后，麻醉状态下腹主动脉取血，吸入麻醉处死动物。大脑TTC染色观察梗死面积。10%甲醛固定，石蜡包埋，病理切片HE染色观察形态学变化。

1.4血清学检测取血液3 000 r/min离心10 min，收集血清。检测血清中LDH和MDA含量，T-SOD活力、GSH-PX活力和CAT活力。

1.5统计学处理采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2　结　果

2.1行为学评分空白组大鼠精神正常，四肢及行走步态均正常，评分为0。模型组大鼠出现不同程度的精神萎靡，提尾对侧前肢不能伸展，行走向对侧倾倒或者不同程度旋转，综合评分为(3.5±0.4)分，大鼠模型制备成功。低剂量组和高剂量组的神经学评分分别为(2.8±0.3)分和(2.1±0.3)分，与模型组相比均明显降低(P<0.05)。

2.2脑梗死面积空白组脑组织无梗死区。模型组梗死区域占整个脑组织的16.4%±4.5%；低剂量组梗死区约占整个脑组织的12.1%±3.7%；而高剂量组梗死区明显减小，约占整个脑组织的8.6%±2.3%。

2.3HE染色结果空白组海马层次、结构清晰，细胞排列整齐、紧密；神经元形态完整，胞核染色清晰，核圆形或椭圆形、核仁明显。模型组海马结构层次紊乱，细胞排列稀疏；细胞周围间隙增宽；部分神经元变性坏死，细胞质与细胞核界限模糊，核固不规则形，核仁不明显，部分细胞核淡染及空泡化。灌胃给鹿角胶的两组显示海马区细胞排列较整齐，神经元胞体肿胀减轻，病理改变均有不同程度的改善。见图1。

2.4血清酶学检测结果与空白组比较，模型组中LDH和MDA含量明显升高(P<0.05)，鹿角胶给药组的LDH和MDA含量均低于模型组(P<0.05)，其中以高剂量组最明显(P<0.05)。与空白组比较，模型组中CAT、T-SOD以及GSH-PX活力明显较低(P<0.01)，与模型组相比，低剂量组和高剂量组的CAT、T-SOD及GSH-PX活力明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

图1　各组大鼠脑组织HE染色结果

组别LDH(U/L)CAT(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)GSH-PX活性T-SOD(U/mgprot)空白组1134.02±169.542.15±0.114.90±0.12556.08±23.4457.06±2.53模型组3976.56±169.561)1.51±0.241)10.17±0.241)317.97±9.631)51.82±1.711)低剂量组1544.90±70.152)2.53±0.072)3.20±0.562)721.83±8.82)77.23±0.532)高剂量组1639.84±162.123)3.54±0.853)4.96±1.203)767.10±14.373)78.53±0.953)

与空白组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05，3)P<0.01

3　讨　论

本研究通过线栓法制备脑缺血大鼠模型，行为学评分结果显示模型组评分显著高于空白组，说明模型制备成功，而鹿角胶给药组的评分明显低于模型组，提示鹿角胶对脑缺血具有一定的保护作用。脑组织TTC染色和HE染色结果显示，与模型组比较，鹿角胶给药组脑组织梗死面积减小，细胞排列整齐，病理改变减轻，进一步证实鹿角胶对脑缺血的保护作用。

脑缺血发生后，氧自由基贯穿于脑组织损伤的多个环节，患者发生脑缺血后也使用相应的清除氧自由基的药物〔8〕。很多中草药对脑缺血具有良好的治疗作用，如芹菜素、葛根素、甘草酸二铵和梓醇等〔9～12〕。研究表明，中药对脑缺血损伤发挥保护作用的机制主要为清除自由基，减轻细胞内钙超载及兴奋性氨基酸的神经毒性，抑制细胞凋亡，阻止炎性反应等〔13,14〕。

LDH是一种糖酵解酶，存在于细胞质内，当组织发生病变和损伤时，细胞破裂，细胞质中的LDH释放入血，血液中LDH升高，通过检测血清中LDH的含量可评价组织的损伤程度。本研究结果显示，模型组LDH含量高于空白组，低剂量、高剂量组LDH含量均低于模型组，表明大鼠发生脑缺血过程中鹿角胶可以降低脑组织损伤的程度。

脑组织缺血缺氧后通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化后，使MDA等脂质过氧化物水平上升，所以血清中MDA可以间接反映组织细胞损伤程度。本研究结果提示大脑发生缺血缺氧时，鹿角胶在一定程度可以通过抗脂质过氧化保护脑组织。SOD、GSH-PX和CAT水平的高低可间接反映机体清除氧自由基的能力。本文结果显示，模型组抗氧化酶活性明显降低，而鹿角胶处理组大鼠血清中抗氧化酶活性明显高于模型组，提示鹿角胶对脑组织保护作用的机制之一是通过抗氧化途径。

综上，鹿角胶具有明显的脑组织保护作用，其机制之一是降低由于脑缺血产生的氧自由基，提高氧自由基清除率，从而减轻脑组织损伤。鹿角胶是否还通过其他途径对脑组织产生保护作用仍需进一步研究。

1李金国，白波.线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型的研究〔J〕.泰山医学院学报，2008；29(4)：308-12.

2陈娜.脑缺血再灌注损伤神经保护策略研究〔D〕.北京：中国人民解放军军事医学科学院，2012.

3彭如枝.鹿角与鹿角胶〔J〕.明胶科学与技术，1994；14(4)：195-8.

4蒙海燕.鹿茸及鹿角胶主要传统功效作用机理研究〔D〕.长春：长春中医药大学，2008.

5陈富军，白克杰，方玉先，等.略述鹿角胶的临床应用及现代研究〔J〕.光明中医，2002；17(5)：50-1.

6王炳高，袁新颜，王守彪，等.线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的改进〔J〕.青岛大学医学院学报，2005；41(1)：73-4.

7李娜.氧化苦参碱对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用〔D〕.长春：吉林大学，2006.

8高迪飞.浅谈抗脑缺血药物的研究进展〔J〕.中国保健营养，2012；22(12)：5484-5.

9刘婵，涂丰霞，陈翔.芹菜素对大鼠急性脑损伤的保护作用〔J〕.中草药，2009；40(10)：1598-602.

10汪亮.葛根素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后TLR4/NF-κB信号通路的影响〔D〕.宁波：宁波大学，2012.

11侯绍章.甘草酸二铵对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究〔D〕.南京：南京中医药大学，2012.

12祝慧凤，万东，罗勇，等.梓醇上调 GAP-43 表达伴随局灶脑缺血大鼠神经功能恢复〔J〕.中国药理学通报，2007；23(9)：1231-6.

13齐聪儒，孔祥玉.中药对脑缺血再灌注损伤保护作用的研究进展〔J〕.承德医学院学报，2008；25(3)：316-8.

14Al Rouq F，El Eter E.PPAR-γ activator induces neuroprotection in hypercholesterolemic rats subjected to global cerebral ischemia/reperfusion injury：In vivo and in vitro inhibition of oxidative stress〔J〕.Exp Gerontol，2013；51(1)：1-7.

〔2015-12-15修回〕

(编辑李相军)

吉林省教育厅资助课题〔吉教科合字(2014)第98号〕

李娜(1978-)，女，副教授，博士，主要从事中药药理研究。

李辉(1978-)，男，医师，主要从事中药药理研究。

R282174

A

1005-9202(2016)16-3895-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.011

1吉林大学基础医学院病理生理学系

2长春中医药大学