JAK2/STAT3信号转导通路在岩大戟内酯B诱导的前列腺癌细胞PC-3凋亡中的作用

王贻兵,刘　丹,王佳贺



JAK2/STAT3信号转导通路在岩大戟内酯B诱导的前列腺癌细胞PC-3凋亡中的作用

王贻兵a*,刘丹b,王佳贺b

目的探讨岩大戟内酯B诱导的人前列腺癌细胞系PC-3细胞凋亡以及JAK2/STAT3信号转导通路在此过程中的作用。方法不同浓度的岩大戟内酯B处理人前列腺癌细胞系PC-3细胞0、24、48、72 h后，采用台盼蓝染色法检测PC-3细胞存活率；采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测PC-3细胞凋亡率；Western blot分析检测岩大戟内酯B作用不同时间后JAK2/STAT3信号转导通路的表达；预先用不同浓度的JSI-124(选择性STAT3途径抑制剂)处理PC-3细胞60 min，观察岩大戟内酯B作用不同时间后PC-3细胞的凋亡情况。结果岩大戟内酯B能够诱导前列腺癌细胞PC-3凋亡，降低磷酸化-JAK2/STAT3的表达，JSI-124可以提高岩大戟内酯B诱导的PC-3细胞凋亡率。结论JAK2/STAT3信号转导通路参与了岩大戟内酯B诱导的PC-3细胞凋亡过程。JSI-124通过特异性地抑制STAT3活性提高了岩大戟内酯B诱导的PC-3细胞凋亡率。

岩大戟内酯B；前列腺癌；PC-3细胞；细胞凋亡

0　引言

前列腺癌好发于中老年男性，已成为危害男性生命的重要疾病之一。近年来，随着我国人口老龄化及经济水平的提高，前列腺癌的发病率亦逐年上升[1]。狼毒大戟(EuphorbiafischerianaSteud)为大戟科植物，含有多种化学成分，岩大戟内酯B(Jolkinolide B)广泛存在于狼毒大戟中，属二萜类[2]。研究发现，岩大戟内酯B具有广泛的抗肿瘤活性[3-5]，能够诱导白血病、乳腺癌细胞等多种肿瘤细胞凋亡。然而关于岩大戟内酯B能否诱导人前列腺癌细胞凋亡及其相关机制的研究较少。本研究探讨了岩大戟内酯B对前列腺癌细胞株PC-3细胞凋亡和JAK2/STAT3信号转导通路的影响，以进一步探讨岩大戟内酯B治疗前列腺癌的机制。

1　材料和方法

1.1主要试剂及仪器RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司;Bcl-2、Bax抗体、磷酸化及非磷酸化JAK2/STAT3抗体及其他试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司；流式细胞仪购自美国Backman公司；离心机购自德国Eppendorf 公司。PC-3细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.2细胞培养将PC-3细胞置于含有10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3岩大戟内酯B作用于PC-3细胞当岩大戟内酯B的浓度分别为0、30、60 及120 μg/mL时，分别与PC-3 细胞培养0、24、48及72 h。

1.4细胞活力测定采用台盼蓝拒染法，同一实验重复3次。将不同浓度的岩大戟内酯B分别与人前列腺癌细胞株PC-3细胞培养0、24、48及72 h后，取对数生长期的细胞，用0.4%台盼蓝染色5 min，在显微镜下观察。其中，死细胞染成蓝色。计数未染色的细胞数和总的细胞数，细胞存活率为未染色的细胞占总的细胞的百分率。

1.5AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞仪检测PC-3细胞的凋亡情况收集对数生长期的PC-3细胞，加入不同浓度的岩大戟内酯B，分别作用0、24、48及72 h后，收集细胞，调整待测PC-3细胞的浓度为5×105个/mL，用500 μL 的Binding Buffer 将PC-3细胞重悬，先加入5 μL AnnexinV-FITC，再加入5 μL Propidium iodide(PI)混匀，4 ℃避光结合15 min后，采用流式细胞仪测定PC-3细胞的凋亡率。

1.6Western blot检测磷酸化及非磷酸化JAK2/STAT3的表达岩大戟内酯B分别处理PC-3 细胞0、24、48及72 h，提取总蛋白。检测蛋白浓度，进行蛋白定量。等量蛋白用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳。电泳条带转移至PVDF 膜。用2%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入一抗(兔抗人非磷酸化-JAK2、非磷酸化-STAT3以及磷酸化-JAK2、磷酸化-STAT3、Bcl-2、Bax、β-actin)，4 ℃过夜。TBST (含0.1% Tween 20-Tris 缓冲液)洗膜 2 次，每次15 min；加入稀释后的羊抗兔 IgG 二抗(稀释比例为1∶6 000)，室温条件下反应 1 h；洗膜后按PIERCE 化学发光试剂盒说明书，进行蛋白条带的灰度值检测。实验重复3次。

2　结果

2.1细胞活力测定台盼蓝染色结果发现，当岩大戟内酯B的浓度逐渐升高及作用时间逐渐延长时，各实验组被染成蓝色的细胞数量亦逐渐增多,提示坏死的PC-3细胞逐渐增多,并且岩大戟内酯B对PC-3细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性，见图1。

图1　岩大戟内酯B对前列腺癌细胞PC-3生长的影响

2.2流式细胞仪分析检测前列腺癌细胞系PC-3细胞凋亡分别以0、30、60及120 μg/mL浓度的岩大戟内酯B作用于前列腺癌细胞系PC-3不同时间后，细胞均发生凋亡，并且呈浓度及时间依赖性。当岩大戟内酯B浓度为30、60及120 μg/mL时，作用48 h后，PC-3细胞的凋亡率与0 μg/mL相比，以及当岩大戟内酯B浓度为60 μg/mL 时，分别作用24、48及72 h后，PC-3细胞的凋亡率与0 h相比，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.001)。结果见图2。

图2　Annexin V FITC/PI 双染流式细胞仪分析检测前

2.3岩大戟内酯B对磷酸化及非磷酸化JAK2/STAT3以及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响岩大戟内酯B作用不同时间后，免疫印迹法检测磷酸化及非磷酸化JAK2/STAT3的表达。结果显示，经岩大戟内酯B作用PC-3细胞0、24、48及72 h后，磷酸化JAK2/STAT3蛋白的表达水平随着岩大戟内酯B作用时间的延长逐渐下降，提示岩大戟内酯B可抑制JAK2/STAT3的活化。同时，结果发现，随着岩大戟内酯B作用时间的延长，促凋亡蛋白Bax 的表达水平逐渐升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达逐渐下降(图3)。

2.4STAT3抑制剂JSI-124对PC-3细胞凋亡率的影响预先用不同浓度的JSI-124处理PC-3细胞60 min，观察岩大戟内酯B作用不同时间后PC-3细胞的凋亡情况，结果显示，PC-3细胞的凋亡率随着JSI-124浓度的增加而逐渐升高。

图3　岩大戟内酯B对JAK-STAT3、Bcl-2和Bax表达的影响

3　讨论

研究表明，肿瘤细胞增殖和凋亡的失调控是导致恶性肿瘤发生发展的重要原因之一。因此，抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗肿瘤的主要手段之一[6-7]。但目前诱导肿瘤凋亡的西药多因合并严重的不良反应而使其临床应用受到了限制。因此，从中药中提取高效低毒的抗肿瘤药物已经成为国内外研发新药的重要途径[8]。药理学研究证实，岩大戟内酯B具有抗白血病、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤的作用，其机制包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤组织生长等[9-10]。但是，关于岩大戟内酯B如何诱导前列腺癌细胞凋亡及其机制，目前研究较少。

凋亡是一个高度复杂的、严格的细胞程序性死亡的过程，是细胞自身的一种受促凋亡因子和抑制凋亡因子共同调节的生理性死亡机制[11-12]。本实验结果发现：岩大戟内酯B能够诱导前列腺癌细胞株PC-3细胞发生凋亡，抑制PC-3细胞增殖，并且呈时间及剂量依赖性。

Bcl-2、Bax在细胞凋亡调控过程中起非常关键的作用。Bax促进凋亡，而Bcl-2的作用与之相反[13]。本研究发现，随着岩大戟内酯B作用时间的延长，Bax的表达水平逐渐升高，而Bcl-2的表达逐渐下降，进一步证实岩大戟内酯B能够诱导PC-3细胞凋亡。STAT3是转录因子STAT 家族的成员，同时也是表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)下游信号通路JAK-STAT3的关键因子[14-15]。磷酸化-STAT3(p-STAT3)可作用于细胞核内特异的DNA结合位点，调节下游基因表达，直接或间接上调Bcl-2、Bcl-XL和cyclin D1/D2等抑制凋亡的基因的表达[16-18]。本研究发现，磷酸化JAK2/STAT3蛋白的表达随岩大戟内酯B作用时间延长明显下降，说明JAK2/STAT3信号转导通路参与了岩大戟内酯B诱导的前列腺癌细胞凋亡的调控。加入不同浓度的STAT3抑制剂JSI-124后，随着JSI-124浓度的逐渐增加，PC-3细胞的凋亡率亦逐渐升高。提示JSI-124通过特异性地抑制STAT3信号转导通路，提高了岩大戟内酯B诱导的PC-3细胞凋亡率。进一步证明了JAK2/STAT3信号转导通路参与了岩大戟内酯B诱导的PC-3细胞凋亡过程。

综上所述，岩大戟内酯B能够抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖，促进其凋亡，其机制可能与岩大戟内酯B下调PC-3细胞磷酸化JAK2/STAT3的表达，继而启动细胞凋亡相关。

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Effect of JAK2/STAT3 signaling transduction on the apoptosis of PC-3 cells of prostate cancer induced by Jolkinolide B

WANG Yi-binga*,LIU Danb,WANG Jia-heb

(a.Department of Urinary Surgery，b.Department of Geriatrics，Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004, China)

ObjectiveTo investigate the role of the JAK2/STAT3 pathway in the apoptosis of prostate cancer PC-3 cells induced by Jolkinolide B,a bioactive diterpene isolated from the roots ofEuphorbiafischerianaSteud.MethodsThe PC-3 cells were treated with different doses of Jolkinolide B at different time points.Growth inhibition was analyzed by trypan blue stain.Cell apoptosis of PC-3 cells was detected by Annexin V-FITC/PI staining.Expression of JAK2/STAT3 was detected by Western blot.In some experiments,PC-3 cells were pretreated with JSI-124(an inhibitor for STAT3),and the apoptosis rates of PC-3 cells were detected.ResultsWe found that Jolkinolide B reduced cell viability and induced apoptosis in a dose- and time- dependent manner in PC-3 cells.The induction of apoptosis was accompanied by the down-regulation of phosphorylation-JAK2/STAT3.Moreover,we observed that JSI-124 treatment resulted in apoptosis of PC-3 cells.ConclusionThe signaling pathway JAK2/STAT3 participates in the apoptosis of PC-3 cells induced by Jolkinolide B.JSI-124 increases PC-3 cell apoptosis induced by Jolkinolide B by inhibiting the activity of JAK2/STAT3.

Jolkinolide B;Prostate cancer;PC-3 cells;Apoptosis

2016-07-07

中国医科大学附属盛京医院a.泌尿外科，b.老年病科， 沈阳110004

辽宁省科技攻关项目(2013225086);国家自然基金青年基金项目(81101224);盛京自由研究者计划项目(201206)

10.14053/j.cnki.ppcr.201609002