阿奇霉素对新生大鼠高氧肺损伤的防治作用及其机制

金梅花，金正勇，申英花

(延边大学附属医院，吉林延吉133000)



阿奇霉素对新生大鼠高氧肺损伤的防治作用及其机制

金梅花，金正勇，申英花

(延边大学附属医院，吉林延吉133000)

目的观察阿奇霉素对新生大鼠高氧肺损伤的防治作用，并探讨其机制。方法 选用2 d龄新生Wistar大鼠90只，随机分为对照组、模型组、实验组，每组30只。模型组和实验组大鼠暴露在高氧模型箱内制作高氧肺损伤模型，实验组大鼠同时腹腔注射阿奇霉素200 mg/(kg·d)，连用14 d。各组分别于建模3、7、14 d各处死10只大鼠，测定肺组织湿/干重比(W/D)，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)测定白细胞总数，观察肺组织病理变化，采用Western blotting法检测肺组织中的Bcl-2蛋白、Bax蛋白、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)。结果 模型组建模3、7、14 d时肺组织W/D高于对照组和实验组(P均<0.05)。模型组建模3、7、14 d时BALF中白细胞总数高于对照组和实验组(P均<0.05)。对照组建模3、7、14 d时肺泡结构无明显改变，无间质水肿，见少许炎症细胞；模型组随建模时间延长，肺组织损伤加重；实验组建模后不同时间肺水肿程度、炎症细胞量、肺泡体积等均较模型组明显减轻。模型组建模3、7、14 d时肺组织中Bax蛋白相对表达量高于对照组和实验组，Bcl-2蛋白相对表达量低于对照组和实验组，Bcl-2/Bax低于对照组和实验组，CHOP、GRP78相对表达量高于对照组和实验组(P均<0.05)。结论 阿奇霉素可防治新生大鼠高氧肺损伤，这种作用可能与减少肺组织细胞凋亡及下调CHOP、GRP78表达有关。

阿奇霉素；肺损伤；内质网应激；葡萄糖调节蛋白78；CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白；新生大鼠；动物实验

新生儿重症监护中常用到高氧辅助通气治疗，虽然新生儿抢救技术不断发展进步，但支气管肺发育不良(BPD)仍是未成熟儿最常见的慢性肺损伤性疾病[1，2]。内质网应激反应性凋亡通路被认为与高氧肺损伤有紧密联系。未折叠蛋白反应是保守的细胞反应，多在细胞受某些环境因素影响发生内质网应激、异常蛋白内质网空腔内堆积或未折叠蛋白异常增多时出现。活性氧簇(ROS)在高氧暴露时产生增多，是导致肺部细胞死亡和高氧损伤的主要原因，且过量的ROS引起的细胞死亡与内质网应激反应引起的细胞凋亡有关[3，4]。多种信号通路和分子参与了内质网应激反应，其中CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是反映内质网应激最敏感的指标。CHOP分布在细胞质中，含有亮氨酸拉链结构。GRP78在内质网应激中引起重要的调节作用。阿奇霉素半衰期长，有良好的抗菌药物后效应，具有免疫调节作用及抗炎作用[5]。2014年2月～2015年4月，我们通过高氧诱导制作了肺损伤新生大鼠模型，观察阿奇霉素对高氧肺损伤的防治作用，并探讨其机制，为阿奇霉素治疗BPD相关研究提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物及试剂2 d龄新生Wistar大鼠90只，体质量5～10 g，雌雄不限，由延边大学实验动物中心提供。阿奇霉素由国瑞药业有限公司提供；GADD153/CHOP、GRP78、Bax、Bcl-2、山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记由美国 Satacuz 公司提供；山羊抗兔IgG/辣根酶标记由中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.2高养肺损伤新生大鼠模型制作及阿奇霉素用法90只新生大鼠随机分为对照组、模型组和实验组，每组30只。对照组大鼠置于室内空气中；模型组、实验组大鼠置于高氧模型箱(保持氧浓度高于90%)内，箱内放置碱石灰粉吸收CO2，每日开箱约1 h，换垫料，保持湿度55%～65%、室温25 ℃左右。对照组与模型组互换雌鼠。实验组同时腹腔注射阿奇霉素200 mg/(kg·d)，模型组不注射药物。

1.3观察方法各组分别于建模3、7、14 d，每组10只，各组进行麻醉后，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行白细胞计数；取肺组织，测定肺组织湿/干重比(W/D)；HE染色观察肺组织病理变化；采Western blotting法测定肺组织中的Bcl-2蛋白、Bax蛋白、CHOP、GRP78，以凝胶成像系统扫描分析结果，将目的蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2　结果

2.1各组肺组织W/D及BALF中白细胞数比较模型组建模3、7、14 d时肺组织W/D高于对照组和实验组(P均<0.05)。模型组建模3、7、14 d时BALF中白细胞总数高于对照组和实验组(P均<0.05)。详见表1。

表1　各组肺组织W/D及BALF中白细胞数比较

注：与实验组、对照组同时点相比，*P<0.05。

2.2各组肺组织病理变化对照组建模3、7、14 d时肺泡结构无明显改变，无间质水肿，见少许炎症细胞。模型组建模3 d时肺泡血管壁、小支气管壁稍有水肿，肺内小血管轻度扩张充血，偶见少量纤维组织增生，少量炎症细胞浸润；建模7 d时血管壁、小支气管水肿及纤维组织增生程度较建模3 d时加重，炎症细胞增多，出现肺泡融合，可见不同程度扩大的肺泡腔；建模14 d时出现肺泡纤维化，小支气管壁和血管壁水肿明显，肺泡体积增大，肺泡融合，间质内炎症细胞浸润增多，肺结构明显紊乱。实验组建模后不同时间肺水肿程度、炎症细胞数量、肺泡体积等均较模型组明显减轻。

2.3各组大鼠肺组织中Bcl-2蛋白、Bax蛋白、CHOP、GRP78表达比较模型组建模3、7、14 d时肺组织中Bax蛋白相对表达量高于对照组和实验组，Bcl-2/Bax低于对照组和实验组，CHOP、GRP78相对表达量高于对照组和实验组(P均<0.05)。详见表2。

表2　各组大鼠肺组织中Bcl-2蛋白、Bax蛋白、CHOP、GRP78相对表达量比较

注：与实验组、对照组同时点相比，*P<0.05。

3　讨论

随着肺表面活性物质广泛应用、机械通气的应用及早产儿管理技术的提高，早产儿及危重新生儿生存率明显提高。研究[6，7]认为，长时间暴露于高氧环境可导致急、慢性肺损伤，可有支气管肺发育不良等后遗症，并可造成早产儿视网膜病变、睡眠呼吸障碍、神经发育延迟等。高氧环境中，肺组织细胞出现凋亡，这是一种特殊的细胞死亡方式，以细胞形态的迅速变化和功能损害为特点，在急性肺损伤中起重要作用[8]。早产儿肺发育不良对患儿在儿童期及青春期的肺功能有不同影响，患儿胎龄越小，儿童期及青春期时肺功能损伤风险越大[9]。

人类肺组织中存在大量肺泡，肺泡结构完整性对保证正常气体交换非常重要[10，11]。任何能减弱肺泡稳定性的因素均可引起肺萎缩，造成呼吸窘迫，甚至导致死亡。肺表面活性剂(PS)是一种由脂蛋白复合体和Ⅱ型肺泡上皮细胞合成的物质，其在呼吸周期中起到重要作用，还能维持肺泡表面稳定性，调节肺泡表面张力[12～14]，除此之外，PS还可以控制肺部感染及抑制宿主防御。本研究将2 d龄新生大鼠置于密闭的玻璃箱内，持续通入已知浓度的高氧，制作高氧肺损伤动物模型。病理检查结果显示，高氧环境下新生大鼠肺组织会出现急性肺损伤改变，随着高氧暴露时间延长，损伤程度逐渐加重，表现为肺泡间隔增宽、肺泡融合、血管扩张充血、炎症细胞浸润增多、肺结构紊乱等。高氧可增加组织内表面活性蛋白基因表达，有研究[15]报道表面活性蛋白A(SP-A)和表面活性蛋白D(SP-D)在高氧肺损伤过程中的重要作用，因此其基因表达上调是对高氧的一种适应性反应，增加机体的抗炎和抗氧化功能，有利于机体的防御及修复。

Bcl-2、Bax蛋白共同参与了细胞凋亡过程，Bcl-2/Bax比例下降时细胞凋亡增多。本研究发现，模型组建模3、7、14 d时肺组织中Bax蛋白相对表达量高于对照组和实验组，Bcl-2蛋白相对表达量低于对照组和实验组，Bcl-2/Bax低于对照组和实验组，提示高氧导致肺损伤的机制与诱导细胞凋亡有关。文献[16]报道，高氧损害严重时，氧活性物质的产生与许多信号途径有关[17，18]。未折叠蛋白反应是一种质控机制，在多物种细胞中存在高同源性，可激活转录因子6(ATF6)、ERS相关蛋白双链依赖蛋白激酶内质网激酶(PERK)、肌醇蛋白1(IRE1)等应激受体[19]。上述三种内质网膜蛋白可使内质网中未折叠蛋白聚集，当未折叠蛋白在内质网腔内严重聚集时，GRP78能与ATF6、PERK、IRE1蛋白出现解离反应。GRP78是内质网应激的标志物，在内质网应激中起重要调节作用。CHOP分布在细胞质中，具有亮氨酸拉链结构，也是反映内质网应激最敏感的指标[20，21]。

阿奇霉素属于氮环内酯类，具有抗炎和调节免疫的功能。阿奇霉素与其他大环内酯类抗生素的结构有显著差异，能阻止内部形式半酮缩醛反应。在细菌中，阿奇霉素可与核糖体50S亚基结合，阻止转肽过程，抑制相关蛋白合成，从而发挥抗菌作用。阿奇霉素还可诱导嗜酸性粒细胞凋亡，促进WBC凋亡、影响WBC趋化活性，直接抑制外周血中性粒细胞释放ROS，减少组胺释放，从而达到抗炎的目的[22]。本研究用阿奇霉素作用于高氧肺损伤新生大鼠，发现建模后不同时间实验组肺损伤程度较模型组明显减轻，且肺组织W/D、BALF中白细胞总数低于模型组，提示阿奇霉素对新生大鼠高氧肺损伤有防治作用。我们进一步研究发现，实验组建模3、7、14 d时肺组织中Bax蛋白、CHOP、GRP78相对表达量低于模型组，Bcl-2蛋白相对表达量及Bcl-2/Bax高于模型组，推测阿奇霉素对高氧肺损伤的防治作用可能是通过减少细胞凋亡、下调CHOP、GRP78表达实现的，具体机制仍需进一步研究证实。

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国家自然科学基金资助项目(81160083)。

金正勇(E-mail: jinzhengyong2003@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.012

R563.9

A

1002-266X(2016)31-0040-03

2016-03-18)