α-硫辛酸对脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡的抑制作用及其机制

高路燕,王洪新,董银华,梁佩芬,赵岚,范宏光

(天津市第四中心医院,天津300000)



α-硫辛酸对脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡的抑制作用及其机制

高路燕,王洪新,董银华,梁佩芬,赵岚,范宏光

(天津市第四中心医院,天津300000)

目的探讨α-硫辛酸对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法 取健康雄性Wistar大鼠45只，随机分为假手术组、模型组、α-硫辛酸组各15只，采用线栓法制作大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，TUNEL法测算细胞凋亡指数(AI)；免疫组织化学法和Western blotting法检测各组细胞色素C(CtyC)、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果与假手术组比较，模型组及α-硫辛酸组AI均升高，CtyC、Bcl-2、Bax阳性细胞百分比及其表达均升高(P均<0.05)；与6 h比较,α-硫辛酸组24、72 h AI均升高(P均<0.05)。与模型组比较，α-硫辛酸组各时间AI均降低(P均<0.05)，CtyC及Bax蛋白阳性细胞百分比及其表达降低，而Bcl-2蛋白表达增高(P均<0.05)。结论 α-硫辛酸对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡有抑制作用，其机制可能与降低CtyC及Bax蛋白表达，提高Bcl-2蛋白表达有关。

脑缺血再灌注损伤；α-硫辛酸；细胞色素C；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；大鼠

脑缺血再灌注损伤是治疗缺血性脑病常见的并发症，可造成脑组织的二次损伤，对患者脑组织功能的恢复产生严重影响。研究表明，氧化应激是脑缺血再灌注损伤、细胞凋亡的重要机制[1]，细胞凋亡与细胞色素C(CtyC)及Bcl-2家族基因有关。α-硫辛酸是否可以通过抗氧化机制，并影响Bcl-2及Bax而抑制脑缺血再灌注后细胞凋亡，尚未见文献报道。2013年8月～2015年6月，我们观察了α-硫辛酸对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响及CtyC、Bcl-2、Bax表达的变化。

1　材料与方法

1.1材料健康雄性Wistar大鼠(SPF级别)45只，体质量220～240 g，由中国人民解放军医学科学实验动物中心提供。TUNEL凋亡试剂盒(美国罗氏公司)，兔抗鼠CtyC、Bcl-2、Bax抗体(Abcam 公司，美国)；α-硫辛酸(德国史达德大药厂生产)；免疫组化试剂盒(北京博奥森)；BCA蛋白定量试剂盒(江苏碧云天)；低温冷冻离心机(北京奥博通光学仪器有限公司)；显微镜及图像处理系统(天津医科大学)；凝胶图像分析系统(JD-801 江苏捷达)。

1.2局灶性脑缺血再灌注模型制作及分组将45只大鼠随机分为假手术组、模型组和α-硫辛酸组，每组各15只。将动物置于实验室适应环境1周，自由进食水，室温(24±2)℃，自然光照，术前禁食12 h，参照Zea-Longa法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，尼龙线直径0.24 mm，线段头端烧制成光滑、大小一致的球状。大鼠称重后以10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉，沿颈前正中切开皮肤，分离出右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。颈总动脉近心端以手术线结扎，用眼科剪在结扎线远端剪一小口，将尼龙线插入颈内动脉达大脑中动脉，深度18～20 mm，栓线的血管外部分结扎固定，2 h后拔除线栓，实现再灌注。假手术组结扎动脉但不插入栓线。α-硫辛酸组在脑缺血再灌注后2 h按70 mg/kg腹腔注射α-硫辛酸药物；模型组给予相应体积生理盐水；假手术组不给药。因任何原因造成死亡的大鼠剔除。

1.3细胞凋亡指数(AI)的测算采用TUNEL法。每组大鼠分别于脑缺血再灌注后各个时间点断头取脑，4% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液固定过夜，转放入30%蔗糖中脱水，4 ℃存放，用梯度乙醇脱水，包埋切片。显微镜观察切片：正常细胞胞核呈蓝色，细胞核中显示有棕黄色颗粒的为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片在显微镜下随机选取5个不重叠的高倍镜视野(400×)，计算凋亡细胞数和细胞总数，然后计算AI，AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.4CtyC、Bcl-2及Bax蛋白表达检测①CtyC、Bcl-2、Bax阳性细胞率:采用免疫组织化学法。取石蜡切片脱蜡，蒸馏水洗，按照说明书分别进行CtyC、Bcl-2、Bax免疫组织化学染色，光镜下观察胞质有棕色颗粒者为阳性细胞。部分切片不加一抗，用0.01 mmol/L PBS代替，作为阴性对照组。在光镜视野下，随机选取5个梗死边缘区视野，计数CtyC、Bcl-2、Bax阳性细胞数，计算细胞阳性率。② CtyC、Bcl-2及Bax蛋白相对表达量:采用Western blotting法。各组大鼠于再灌注6、24、72 h断头取脑，-80 ℃保存，取缺血侧皮质100 mg，加入细胞裂解液中，4 ℃、1 200 r/min离心20 min，检测蛋白量。取等蛋白样品，用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白质，转移至硝酸纤维素膜，用10%脱脂牛奶封闭1 h后加入兔抗鼠CtyC、Bcl-2及Bax抗体，4 ℃孵育过夜，TEST洗膜3次，每次12 min，加入二抗后室温孵育，洗膜，显色液中显色，曝光后保存图片，以β-actin为内参，应用凝胶图像分析系统软件对蛋白条带进行灰度扫描，测定其灰度值，计算CtyC与内参β-actin的比值、Bcl-2与Bax的比值。

2　结果

2.1各组不同时点AI比较假手术组凋亡细胞很少出现；与假手术组相比，模型组于6 h即出现凋亡细胞明显增多，胞核呈棕黄色，固缩深染，至24 h细胞最多。各组不同时点AI比较见表1。

表1　各组不同时点AI比较

注：与假手术组相比，#P<0.05;与模型组相比，*P<0.05;与同组6 h比较，ΔP<0.05 。

2.2 各组CtyC、Bcl-2、Bax蛋白阳性细胞率及其相对表达量比较见表2、3。

表2　各组不同时点CtyC、Bcl-2、Bax蛋白阳性细胞率比较

注：与假手术组相比，#P<0.05;与模型组相比，*P<0.05。

表3　各组不同时点CtyC、Bcl-2及Bax蛋白相对表达量及Bcl-2/Bax比较

注：与假手术组同时间相比，#P<0.05;与模型组同时间相比，*P<0.05。

3　讨论

诸多研究显示，氧化应激是脑缺血再灌注损伤的重要机制，在大脑组织缺血受损后，组织细胞启动凋亡程序和抑制凋亡程序，其代表的典型基因如Bcl-2家族中的成员及线粒体CtyC，包括促细胞凋亡的Bax和抑制细胞凋亡的Bcl-2，其中Bax可形成同源二聚体，参与组成线粒体膜上的活化离子通道，使得CtyC由此穿过线粒体膜而到达细胞质内，与细胞质内的相关蛋白结合形成凋亡启动复合体，激活Caspase主导的级联反应，最终破坏细胞内DNA及蛋白成分，导致细胞凋亡[2]。而Bcl-2作为抗凋亡成员，可与Bax竞争结合，按1∶1方式结合形成异源二聚体，从而灭活线粒体膜上的离子通道，阻止CtyC进入细胞质，最终抑制细胞凋亡。相关研究[3]已证实Bcl-2与Bax的比值较高，提示细胞在受生存信号调节，反之在受凋亡信号调节。

α-硫辛酸属于硫醇类化合物，是一种强力抗氧化剂，兼具有水溶性和脂溶性，可高浓度存在于细胞内外，具有清除活性氧自由基的能力，是人体不可缺少的抗氧化剂，目前主要应用于糖尿病周围神经病变的治疗。有研究[4]提出α-硫辛酸可减轻H2O2诱导的神经细胞氧化应激损伤，对脑缺血损伤亦具有保护作用。

本研究结果显示，模型组脑缺血再灌注6 h即出现神经细胞凋亡，24 h达到最大，72 h后稍有改善，当用α-硫辛酸预处理6 h后，小鼠AI较模型组降低，说明α-硫辛酸早期即有抑制脑组织细胞凋亡作用，与何明利等[5]研究一致。

将各组脑组织进行CtyC、Bcl-2及Bax免疫组织化学染色，发现正常脑组织中均有少量CtyC、Bcl-2及Bax阳性细胞，结合Western blotting检测结果，说明正常脑组织均有少量CtyC、Bcl-2及Bax表达，维持正常的组织功能。脑缺血再灌注6 h后上述蛋白表达有明显升高，24后达到高峰，其中Bax较Bcl-2增高更多，即Bcl-2/Bax值越来越小，提示促细胞凋亡作用占主导优势。当用α-硫辛酸干预后，Bcl-2表达进一步增高，而CtyC与Bax表达减低，通过上调Bcl-2/Bax值逆转促凋亡作用为抗凋亡作用，增多的Bcl-2-Bax二聚体抑制线粒体膜上的CtyC转移到胞质内，抑制细胞凋亡。说明α-硫辛酸可通过抗氧化应激作用，提高Bcl-2表达，抑制CtyC及Bax表达，提高Bcl-2/Bax值，从而减少脑缺血再灌注引起的细胞凋亡，减少梗死体积，降低神经功能损伤。

有研究[6～8]发现，黄芪、三七、黄芩及低温联合硫化氢均可一定程度改善脑缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡，保护脑组织，但作用机制不尽相同。α-硫辛酸对于脑缺血再灌注损伤的保护作用较上述药物有无优势，尚需进一步研究。

[1] 王钊.氧化应激与脑缺血-再灌注损伤[J].国际病理科学与临床杂志,2012，32(4):343-346.

[2] Burguillos MA, Hajji N, Englund E, et al. Apoptosis-inducing factor mediates dopaminergic cell death in response to LPS-induced inflammatory stimulus evidence in Parkinson′s disease patients[J]. Neurobiol Dis, 2011,41(1):177-188.

[3] Lalier L, Cartron PF, Juin P, et al. Bax action and mitochondrial insertion during apoptosis[J]. Apoptosis, 2007,12(5):887-896.

[4] 施红敏,韦晟.α-硫辛酸注射液对过氧化氢致PC12细胞损伤的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2011,27(6):450-453.

[5] 何明利,陈曼娥,王景周.鼠脑缺血性损伤程度与缺血时间的关系研究[J].临床神经病学杂志,2000，13(1):13-15.

[6] Zheng WX, Cao XL, Wang F, et al. Baicalin inhibiting cerebral ischemia /hypoxia-induced neuronal apoptosis via MRTF-A-mediated transactivity[J]. Eur J Pharmacol, 2015,767(15):201-210.

[7] Huang XP, Huang D, Lu JD, et al. Effects of the combination of the main active components of astragalus and panax notoginseng on inflammation and apoptosis of nerve cell after cerebral ischemia-reperfusion[J]. Am J Chin Med, 2015，43(7)：1-20.

[8] Dai HB, Xu MM, Lv J, et al. Mild hypothermia combined with hydrogen sulfide treatment during resuscitation reduces hippocampal neuron apoptosis via NR2A, NR2B, and PI3K-Akt signaling in a rat model of cerebral ischemia-reperfusion injury[J]. Mol Neurobiol, 2015，56(9)：1-9.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.011

R749.1

A

1002-266X(2016)29-0034-03

2016-02-02)