胃癌患者Vav1基因E59K位点多态性分布变化及意义

张明明，檀碧波，赵培，于悦卿，张翠改，刘欣

(1河北省人民医院,石家庄050051；2河北医科大学第四医院)



胃癌患者Vav1基因E59K位点多态性分布变化及意义

张明明1，檀碧波2，赵培1，于悦卿1，张翠改1，刘欣1

(1河北省人民医院,石家庄050051；2河北医科大学第四医院)

目的探讨胃癌患者外周血Vav1基因E59K位点多态性的分布变化及意义。方法 选取350例胃癌患者作为胃癌组，同时取200例体检健康者作为对照组。化学发光法测定血清肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、铁蛋白(FER)、糖类抗原72-4(CA72-4)水平；ELISA法检测血清Vav1及IL-2水平；PCR法检测外周血Vav1基因E59K位点多态性的分布情况。对两组患者各指标进行比较，并就各指标与胃癌的关系进行Logistic相关分析。结果 与对照组比较，胃癌组血清中Vav1、CEA、FER、CA72-4水平均升高，IL-2水平降低(P均<0.05)。外周血Vav1基因E59K位点多态性有AA、GA、GG三种基因型。胃癌组中AA、GA的基因型频率及A等位基因频率均高于对照组(P均<0.05)。胃癌组和对照组按E59K基因型分组后发现IL-2的水平随GG基因型、GA基因型、AA基因型逐渐降低，Vav1的水平逐渐升高(P均<0.05)。Logistic回归分析结果显示，AA基因型与胃癌关系密切，是胃癌的独立危险因素(OR=2.67，95%CI为1.814～6.474，P=0.003)。结论 胃癌患者Vav1基因E59K位点多态性中，以AA基因型为主，该基因型可能通过升高Vav1、降低IL-2水平，从而促进胃癌发生发展。

胃肿瘤；Vav1基因；基因多态性；E59K位点

胃癌早期即可能出现局部侵袭、远处转移，已成为严重危害人类健康的恶性肿瘤，手术不能达到根治效果，化疗药物有效率也不理想[1]。胃癌发生与多种因素有关，其中遗传因素在肿瘤的发生发展中发挥了重要作用[2～4]。白细胞介素2(IL-2)作用于T细胞、B细胞、巨噬细胞等，刺激免疫细胞生长、增殖并诱导细胞毒作用[5, 6]。研究证明，IL-2能诱导和增强细胞毒活性，单独使用或与其他药物联合已广泛用于肿瘤治疗[7]。Vav1基因具有原癌基因特征，能诱导肿瘤发生、促进肿瘤生长、侵袭及转移[8]。E59K突变是发生在Vav1蛋白CH区域的突变，有研究证实，该突变与恶性肿瘤发生有关。但该突变与胃癌之间相关性的报道少见。还有研究证实，Vav1可以调节IL家族成员表达，而胃癌患者Vav1基因多态性与IL-2的关系也尚无报道。本文中，我们检测了胃癌患者与正常人外周血中的Vav1基因E59K位点多态性分布，同时探讨了IL-2与Vav1基因突变之间的关系。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2012年7月～2015年12月在河北省人民医院肿瘤科及河北医科大学第四医院普外科确诊的胃癌患者350例(胃癌组)，均由术前活检和术后病理检查确诊。其中男207例、女143例，年龄28～76岁。患者均为首次就诊，未接受过其他任何治疗。同时选取200例同期来本院查体的健康人作为对照组，男118例、女82例，年龄31～77岁。排除肿瘤家族史、胃炎、胃食管反流征等疾病。两组性别、年龄有可比性。

1.2标本采集晨起抽取空腹静脉血7 mL。5 mL放入促凝管中，室温静置30 min，3 000 r/min离心15 min，分离血清，用于肿瘤标志物及炎症因子的检测;2 mL采用 EDTA-K2抗凝，颠倒混匀，用于基因组DNA的提取。

1.3血清癌胚抗原(CEA)、铁蛋白(FER)、糖类抗原72-4(CA72-4)的测定应用i2000化学发光仪(美国雅培公司)测定血清CRA、FER、CA72-4水平。试剂为罗氏(上海)有限公司产品。

1.4血清Vav1、IL-2水平的测定采用ELISA法。Vav1试剂盒(ELISA-015925，R﹠D Systems公司，美国)检测范围：9.3～300 ng/mL，人IL-2试剂盒(Human Interleukin ELISA Kit， ELISA-01016，R﹠D Systems公司，美国)检测范围：7.8～500 pg/mL。严格依据试剂盒的说明书进行操作。

1.5外周血Vav1基因E59K位点多态性分析采用PCR法。①提取基因组DNA：EDTA-K2抗凝血400 μL，按照TIANamp Genomic DNA kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，DP304)说明书提取基因组DNA。②PCR扩增靶基因片段：应用生物学软件Primer6.0设计特异性上下游引物，并将引物序列与GenBank进行比对。引物序列:上游5′-GCCCTGGGCAGGCGGTAGCC-3′，下游5′-GACCCCCGTCTCCAACCCTC-3′。在生物安全柜(青岛海尔，HR40-11A2)中制备反应体系：1×PCR缓冲液，2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP(dUTP∶dTTP=1∶9)，200 μmol/L上下游引物，DNA聚合酶(eurobio)2.5 U Taq，不耐热的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG；罗氏)1 U，目标DNA 5 μL，加无菌水制成反应体系50 μL。20 ℃孵育10 min使UNG 裂解U-DNA。在Eppendorf Mastercycler nexus PCR分析仪设置循环程序，初始变性步骤：95 ℃，10 min。PCR在扩增仪进行35次循环(95 ℃，变性30 s；59 ℃，退火30 s；72 ℃，扩增30 s)，最后72 ℃孵育10 min。扩增的靶基因产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析验证，DL500 TM DNA Marker(Takara)为分子标记物。③核苷酸序列分析：将验证后的PCR扩增产物纯化后在美国ABI 3730XL全自动DNA测序仪上直接测序。为保证测序结果的可靠性，采用双向测序。测定结果用DNAMAN软件(V6.0.3.99汉化版)与GenBank、EMBL、DDBJ数据库中Vav1基因序列进行比对。根据测序结果与基因库基因序列之间的差异，判断突变位点的位置，确定突变位点。

2　结果

2.1胃癌组和对照组血清Vav1、IL-2、CEA、CA72-4、FER水平比较见表1。

2.2Vav1基因E59K位点多态性Vav1基因E59K位点存在两种单核苷酸G和A，共有3种基因型：AA(突变纯合子)、GA(突变杂合子)、GG(野生型)。

表1　两组血清Vav1、IL-2、CEA、CA72-4、FER水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3两组Vav1基因E59K位点基因型分布和等位基因频率比较见表2。

表2　两组Vav1基因E59K位点基因型分布和等位基因频率比较[例(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.4两组E59K突变位点不同基因型间IL-2、Vav1水平比较见表3。

表3　两组E59K突变位点不同基因型间IL-2、Vav1水平比较

注：与同组GG基因型比较，*P<0.05；与同组GA基因型比较，#P<0.05。

2.5胃癌与各观察指标的相关性以是否患有胃癌(无=0，有=1)为因变量，以性别(男=1，女=2)、年龄(<40岁=0,40～50岁=1,51～60岁=2,61～70岁=3,>71岁=4)、IL-2、CEA、CA72-4、FER、Vav1基因E59K基因型(GG=0，GA=1,AA=2)为自变量，进行Logistic回归分析，结果显示基因型，尤其是AA基因型与胃癌关系密切，是胃癌的独立危险因素(OR=2.67，95%CI1.814～6.474，P=0.003)。

3　讨论

胃癌起病隐匿，发现时多为中晚期，肿瘤细胞生长迅速，并向周围侵袭或向远处转移，很难实现临床根治。虽然胃癌的治疗已取得进展，但术后生存率仍低。因此寻找能准确判断肿瘤状态的指标对于胃癌综合诊治有重要意义。已有研究证实，Vav1在多种肿瘤中表达明显增高，具有促进肿瘤生长、扩散、侵袭及远处转移的作用[8]，但Vav1与胃癌关系的研究少见。本研究检测了患者血清Vav1水平，结果显示胃癌组血清Vav1水平明显高于对照组，由此可见，血清Vav1的水平高低与胃癌肿瘤组织存在密切关系。研究还发现按Vav1基因E59K位点GG、GA、AA基因型的顺序，Vav1的水平依次升高。由此推测Vav1基因E59K突变可能影响了Vav1蛋白表达。

Vav1基因位于19号染色体，全长84 699 bp，共有26个外显子，26个内含子，E59K突变是第1外显子中的315位碱基由原来的鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，使其编码的氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸。该突变位于CH结构域的编码基因区域，该结构域正常状态时使蛋白处于失活状态，突变发生后该结构域功能丧失，出现蛋白异常表达。本研究结果显示，胃癌组和对照组均检出GG、GA、AA三种基因型，胃癌组Vav1基因GA、AA基因型频率和A等位基因频率均显著高于对照组，表明Vav1基因E59K位点突变可能与胃癌发生有关。

IL-2主要由活化的CD4+Th1细胞产生，生物活性广泛，可促进Th、CTL、B细胞的增殖、分泌，激活巨噬细胞，在免疫应答中起调控作用。本研究中胃癌组IL-2 的水平明显低于对照组。胃癌组和对照组中GG基因型、GA基因型、AA基因型的IL-2水平依次降低。由此推测，Vav1基因E59K突变可能影响了IL-2的水平。本研究还发现胃癌组肿瘤标志物FER、CEA、CA72-4的水平均明显高于对照组，与文献报道一致。为进一步判断Vav1基因E59K突变在胃癌发生发展中的作用，本研究进行了Logistic回归分析，结果显示，AA基因型与胃癌关系密切，是胃癌的独立危险因素。

总之，本研究发现Vav1基因E59K突变与胃癌有关，该位点突变可能通过促进Vav1在患者体内的表达并降低IL-2水平，从而促进肿瘤发生发展。

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Distribution changes of Vav1 gene E59K site polymorphism in patients with gastric cancer

ZHANGMingming1,TANBibo,ZHAOPei,YUYueqing,ZHANGCuigai,LIUXin

(1HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveTo investigate the distribution changes of Vav1 gene E59K site polymorphism in the periphreal blood of patients with gastric cancer and its significance.MethodsTotally 350 cases of patients with gastric cancer were selected as the gastric cancer group, and 200 cases of healthy people were recruited as the control group. The levels of CEA, FER and CA72-4 were detected in peripheral blood by chemiluminescence. The levels of Vav1 and IL-2 were tested with ELISA. PCR was applied to test E59K site polymorphism of Vav1 gene in the peripheral blood. The various indexes were compared between the two groups, and the relationships of each index with gastric cancer were analyzed. Results Compared with the control group, the levels of Vav1, CEA, FER and CA72-4 in the peripheral blood were higher, whereas the level of IL-2 was lower in the gastric cancer group (allP<0.05). Three kinds of genotypes AA, GA and GG were found for E59K site polymorphism of Vav1 gene. The frequencies of genotypes AA and GA and allelic gene A in the gastric cancer group were higher than those of the control group (allP<0.05). The level of IL-2 gradually decreased in genotypes GG, GA and AA, and the level of Vav1 gradually increased in genotypes GG, GA and AA in the gastric cancer group and the control group (allP<0.05). Logistic regression analysis showed that genotype AA was closely related with progress of gastric cancer, which was an independent risk factor for gastric cancer (OR=2.67, 95%CI: 1.814-6.474,P=0.003). ConclusionIn the Vav1 gene E59K site polymorphism of patients with gastric cancer, genotype AA is mainly found, which might promote the occurrence and development of gastric cancer by increasing Vav1 expression and decreasing IL-2 expression.

stomach neoplasms; Vav1 gene; gene polymorphism; E59K site

河北省医学科学研究重点课题计划(20150131)。

张明明(1976-)，女，博士，副主任检验师，主要研究方向为肿瘤基因突变检测的研究。E-mail: zhangmm197612@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.004

R735.2

A

1002-266X(2016)29-0011-03

2016-04-25)