FoxO1基因多态性与新疆维吾尔族先天性马蹄内翻足的相关性研究*

艾克巴尔·阿不都热西提，程国杰，王晶，王磊

（新疆医科大学附属中医医院，新疆乌鲁木齐830001）

FoxO1基因多态性与新疆维吾尔族先天性马蹄内翻足的相关性研究*

艾克巴尔·阿不都热西提，程国杰，王晶，王磊

（新疆医科大学附属中医医院，新疆乌鲁木齐830001）

目的探索FoxO1基因多态位点rs3751436、rs199728685、rs139436481与新疆维吾尔族先天性马蹄内翻足（ICTEV）的相关性。方法选取70例维吾尔族ICTEV患儿和30例正常健康儿童为研究对象，应用限制性片段长度多态性聚合酶链反应研究实验对象rs3751436、rs199728685、rs139436481多态性位点基因型。运用实时荧光定量聚合酶链反应法检测维吾尔族ICTEV患儿和正常健康儿童肌肉组织FoxO1基因转录水平。采用拟合优度χ2检验分析基因型分布频率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，运用χ2检验法分析FoxO1基因多态位点基因型、等位基因与ICTEV的相关性。结果维吾尔族ICTEV患儿肌肉组织中FoxO1基因转录水平与正常健康儿童比较，差异有统计学意义（P<0.05），其转录水平下调；Hardy-Weinberg平衡检验结果显示，新疆维吾尔族ICTEV患儿与正常健康儿童的FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位点基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。基因型、等位基因关联分析表明，ICTEV组和正常健康儿童rs3751436、rs199728685、rs139436481位点基因型、等位基因分布频率比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论维吾尔族ICTEV与FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位点可能无相关性，但不能排除FoxO1与ICTEV的关联性。

FoxO1；基因多态性；先天性马蹄内翻足

先天性马蹄内翻足（idiopathic congenital talipes equinovarus，ICTEV）是一种常见的严重危害儿童健康的先天畸形，由足下垂、内翻、内收3个主要畸形综合而成。ICTEV病因尚未明确，仅推测遗传、环境、易感基因等因素可能影响胚胎发育而导致马蹄内翻足[1]。国外研究表明，血管发育异常可直接影响肌肉及骨骼的发育，ICTEV发病与幼儿血管发育异常有关[2]。FoxO1作为Forkhead蛋白家族中重要一员，在维持动物血管稳定和保持造血干细胞的健康方面发挥着重要作用[3]，实验显示，缺失FoxO1的基因工程小鼠会出现严重的血管畸形现象，致畸原因可能与FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位点调控血管壁细胞分裂有关。新疆维吾尔族ICTEV发病率约为0.83‰，高于新疆汉族ICTEV发病率（0.43‰），维吾尔族ICTEV患者同胞发病率为15.69%，遗传度为92.86%[4-5]。因此，以新疆ICTEV高发人群维吾尔族为研究对象，探讨FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位点多态性与维吾尔族ICTEV的关系，是进一步了解ICTEV致病机制的有效手段。

1 资料与方法

1.1研究对象

选取2012～2014年新疆医科大学附属中医医院创伤骨科收治的70例维吾尔族ICTEV患儿外周静脉血、足部肌肉组织标本，且所有患儿均符合骨科诊疗常规中ICTEV诊断标准（北京协和医院编写），经X线和手术确诊。其中，男性52例，女性18例；年龄（6.45±2.11）岁。同期收集正常健康儿童30例（维吾尔族20例、汉族10例），男性16例，女性14例；年龄（7.11±2.10）岁。所有血液、组织标本采集均征得研究对象的知情同意，并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1DNA提取使用K3EDTA抗凝真空采血管采集ICTEV患儿、正常健康儿童外周静脉血5ml，置入-20℃冰箱冷冻保存。运用血液全基因组提取试剂盒进行DNA提取，核酸-蛋白分析仪测定260nm和 280nm处吸光值，计算全基因组DNA的浓度和纯度。

1.2.2R NA提取运用组织和细胞总RNA提取法提取ICTEV患儿组、正常健康儿童组足部肌肉组织的总RNA，溶于脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）水。使用美国Invitrogen公司莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶逆转录试剂盒进行RNA逆转录，将逆转录产物cDNA置于-70℃冰箱冷冻保存、备用。

1.2.3引物设计与合成利用Primer 5.0软件设计rs3751436、rs199728685、rs139436481位点正反向以及实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测FoxO1和内参基因β-actin引物。见表1。

表1　引物设计

1.2.4rs3751436、rs199728685和rs139436481位点限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-R FLP）扩增反应总体系25μl，包括10×PCR缓冲液2.5μl，10 mmol dNTP混合液0.5μl，50 mmol MgCl20.8μl，正向引物（5μmol）1μl，反向引物（5μmol）1μl，DNA模板1μl，Platinum Taq DNA聚合酶0.2μl，ddH2O 18μl。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50 s，共35个循环，72℃继续延伸5min。

1.2.5PCR扩增产物限制性酶切采用BstuⅠ限制性内切酶对ICTEV患儿、正常健康儿童的rs3751436、rs199728685、rs139436481位点P扩增产物进行消化。在10μl酶切反应体系中，取5μl PCR扩增产物，加入限制性内切酶BstuⅠ0.5μl、10×buffer 1μl、去离子水3.5μl。37℃孵育过夜，用3%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，根据酶切图谱判断基因型。

1.2.6qR T-PCR检测FoxO1在维吾尔族ICTEV患儿和正常健康儿童肌肉组织中的基因转录水平按照Invitrogen公司Platinum SYBR Green qPCR Super MIX kit使用说明书加入所需试剂及引物。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环（注：βactin为内参基因）。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，应用拟合优度χ2检验分析基因型分布频数是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，用χ2检验法分析FoxO1基因多态位点基因型、等位基因分布频率与ICTEV的关联性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139 436481位点分析结果

ICTEV患儿、正常健康儿童的rs3751436、rs199728685、rs139436481位点扩增产物经BstuⅠ限制性内切酶消化后，rs3751436位点有A、G 2种等位基因，3种基因型：AA、AG、GG；rs199728685位点有C、T 2种等位基因，2种基因型：CC、TT；rs139436481位点有C、T 2种等位基因，2种基因型：CC、TT。见图1。

图1　rs3751436、rs199728685和rs139436481位点PCR-RFLP电泳图

2.2Hardy-Weinberg平衡检验结果

rs3751436、rs199728685、rs139436481位点基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡定律，研究对象具有遗传代表性。见表2。

表2　rs3751436、rs199728685和rs139436481位点基因型分布频率的Hardy-Weinberg平衡检验

2.3ICTEV患儿组与正常健康儿童组rs3751436、rs199728685、rs139436481位点基因型、等位基因分布差异

rs3751436、rs199728685、rs139436481位点基因型、等位基因分布频率在ICTEV患儿组与正常健康儿童组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4FoxO1在维吾尔族ICTEV患儿和正常健康儿童肌肉组织中的转录水平

qRT-PCR检测结果显示，新疆维吾尔族ICTEV患儿足部肌肉组织FoxO1基因与β-actin基因平均密度比值为（0.224±0.015），正常健康儿童足部肌肉组织FoxO1基因与β-actin基因平均密度比值为（0.937±0.026）。ICTEV患儿足部肌肉组织FoxO1基因转录水平低于正常健康儿童（t=4.201，P=0.017）。见图2。

表3　ICTEV患儿组与正常健康儿童组中rs3751436、rs199728685和rs139436481位点基因型、等位基因分布差异的比较例（%）

图2　维吾尔族ICTEV患儿和正常健康儿童足部肌肉组织中FoxO1基因的转录水平

3 讨论

先天性小儿马蹄内翻足是一种较为常见的先天畸形，患儿一出生即在神经、肌肉、骨骼及软骨等方面表现出病理变化，且难以矫正。目前，关于ICTEV的具体病因仍未明确，仅提示遗传因素、环境、毒性物质、易感基因、骨骼发育等可能导致ICTEV的发生[6-7]。相关研究表明，血管断裂或者血管发育缺陷，可发生缺血或血栓导致缺氧，影响肢芽的形成，最后导致马蹄内翻足畸形[8-9]。

FoxO1是FoxO家族中发现最早的成员，它既能促进脂肪、血管等细胞的分化，又在细胞凋亡、DNA损伤/修复、血管形成和肿瘤发生等生物过程中发挥重要作用[10]。FoxO1作为机体重要的转录因子，受PI3K/AKT信号通路调控，使其发生磷酸化，导致转录活性下调，从而抑制FoxO1所调控的下游基因的表达，血管细胞基因谱显示，FoxO1和FoxO3a转录因子通过AKT/HIF通路对血管细胞增殖分化起负向调节，抑制血管形成[11-12]。此外，FoxO1同样能够调节PI3K/AKT或PI3K/PKB信号通路中的下游基因[13]，譬如：PI3K/AKT下游信号AKT-mTOR-p70s6k（促进肌肉合成）、AKT-FoxOs-Atrogin-MuRF信号通路（抑制肌肉分解）[14-15]。在本研究中，维吾尔族ICTEV患儿的FoxO1基因相较于正常健康儿童下降，实验中笔者虽然未能发现FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位点与新疆维吾尔族ICTEV存在关联性，但结合以上研究成果，并不能排除其他FoxO1基因多态位点与ICTEV之间的相关性。

研究中，新疆维吾尔族ICTEC患儿足部肌肉组织中FoxO1基因转录水平显著低于正常健康儿童，FoxO1基因rs3751436、rs199728685、rs139436481位点基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡。在FoxO1基因多态位点基因型、等位基因分布频率与ICTEV相关性分析中，未能证明rs3751436、rs199728685、rs139436481位点与ICTEV存在相关性，其原因可能为：研究对象样本量不足，未能检测出关联连锁信号；FoxO1与ICTEV具有相关性，但rs3751436、rs199728685、rs139436481位点并非关联位点，可能存在其他未被发现的FoxO1基因SNP与ICTEC之间存在联系。因此，在不排除FoxO1基因转录水平的变化而引起ICTEV发病的基础上，扩大研究对象样本量，并探索FoxO1基因其他未知SNP位点，是进一步了解ICTEV致病机制的有效手段。

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（申海菊编辑）

Association betweenFOXO1gene polymorphisms and idiopathic congenital talipes equinovarus of Uighur from Xinjiang*

Aikebaer·Abudurexiti，Guo-jie Cheng，Jing Wang，Lei Wang
（The Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi，Xinjiang 830001，China）

Objective To investigate the association betweenFOXO1gene polymorphisms of rs3751436，rs199728685，rs139436481 and idiopathic congenital talipes equinovarus（ICTEV）of Uighur from Xinjiang. Methods There were 70 Uighur children with ICTEV and 30 normal controls in this study.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）was used to detect their genotypes of polymorphism loci rs3751436，rs199728685 and rs139436481.The qRT-PCR was performed to evaluate the mRNA levels ofFOXO1from the ICTEV patients and the normal controls.The Hard-Weinberg equilibrium for genotypic distribution was estimated by the goodness of fit χ2tests.The relationships of genotype frequency and allelic frequency ofFOXO1with ICTEV were analyzed by χ2tests.Results Compared with the normal controls，the ICTEV patients showed down-regulation ofFOXO1gene transcription（P＜0.05）.The result of goodness of fit χ2tests showed that the genotypic distribution of rs3751436，rs199728685 and rs139436481 of thetwo groups was in Hard-Weinberg equilibrium（P＞0.05）.There was no significant difference in the distribution of the genotype frequency or allelic frequency between both groups（P＞0.05）.Conclusions The rs3751436，rs199728685 and rs139436481 gene loci may not be associated with ICTEV of Uighur from Xinjiang，but the correlation betweenFOXO1and ICTEV could not be excluded.

FOXO1；gene polymorphism；idiopathic congenital talipes equinovarus

R 726.8

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.011

1005-8982（2016）17-0054-05

2015-02-05

国家自然科学基金（No：81160215）

程国杰，E-mail：king-2032169@163.com；Tel：18109913261