乳酸菌发酵茶饮料的工艺优化及其发酵前后香气成分分析

刘佳奇，熊涛，李军波，廖良坤，黄涛

(南昌大学 食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌，330047)



乳酸菌发酵茶饮料的工艺优化及其发酵前后香气成分分析

刘佳奇，熊涛*，李军波，廖良坤，黄涛

(南昌大学 食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌，330047)

以铁观音浸提液为原料，经植物乳杆菌发酵，通过单因素和正交试验确定乳酸菌发酵茶饮料的最佳工艺条件，并采用顶空固相微萃取(HeadspaceSolid-PhaseMicroextraction,HS-SPME)结合气相色谱/质谱联用(GasChromatography-MassSpectrometry,GC-MS)技术分析了乳酸菌发酵茶饮料发酵前后主要挥发性成分。最佳发酵工艺为：果葡糖浆添加量质量浓度为8%，植物乳酸菌发酵剂接种量质量分数为0.1%，发酵温度37℃，发酵时间36h。发酵后的茶饮料较发酵前含有较多的醇类和酯类等挥发性风味成分，使铁观音发酵茶饮料兼有茶香和乳酸菌发酵香气。经离心、调配后所得产品澄清透明、风味独特、口感醇正。

乳酸菌；发酵工艺；茶饮料；风味物质

乳酸菌是一群能利用碳水化合物(主要指葡萄糖)发酵产生大量乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称[1]。大量研究表明，乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，还可以提高食品的保藏性和附加值[2-3]。目前，乳酸菌的特殊生理活性和营养功能[4]，正日益引起人们的重视，乳酸菌饮料也因其营养保健功能和独特风味深受消费者青睐。茶饮料具有方便、天然、营养保健等特点，被誉为“21世纪首选饮料”[5]。目前乳酸菌发酵茶饮料在市场上还未见到，相关研究也不多。陈万庚[6]用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌以绿茶枸杞子为原料，通过浸提、乳酸发酵等工艺生产出了乳酸发酵枸杞绿茶饮料。江洁[7]以玉米淀粉糖浆对红茶进行浸提，对茶浸提液进行乳酸菌和酵母菌的共生发酵，通过一系列实验开发出了发酵红茶饮料。闫刚，熊昌云[8]以云南CTC红茶为原料，经乳酸菌、酵母菌共生发酵，研究了发酵型红茶饮料的加工工艺。目前的研究大多集中在多菌种混合发酵，开发出的产品营养丰富，风味独特，但生产成本高、工艺操作复杂且生产中容易受到杂菌污染，因此不利于工业化生产，而针对乳酸菌单菌种发酵的工艺探索国内外未见报道。积极开发乳酸菌发酵茶饮料，同时发挥茶和乳酸菌的功能，将成为饮料市场上的主力军。

本文选用铁观音茶浸提液为基质，接种植物乳杆菌发酵剂进行发酵，研究其最佳发酵工艺条件，同时对口感风味进行初步探讨，旨在开发一款营养丰富，口感醇正的乳酸菌发酵茶饮料，为后续的规模化生产提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与设备

1.1.1实验材料

铁观音茶叶购买于江西省南昌市茶叶市场，植物乳杆菌菌剂(NCU177)保藏于江西省南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，果葡糖浆、白砂糖均为食品级。

1.1.2主要仪器和设备

YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设厂；DNP-9272型生化培养箱，上海精宏试验设备有限公司；LXJ-IIB型低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；FE20型pH计，Mettler-ToledoGroup；PB203-N型电子天平，Mettler-ToledoGroup；YP5001分析天平，上海良平仪器仪表有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；PAL-1手持式糖度计，广州市爱宕科学仪器有限公司；Agilent7890/7000A三重串联四级杆气质联用仪，安捷伦科技有限公司；手动固相微萃取进样器、50/30μmDVB/CAR/PDMS57328-U萃取头，美国Supelco公司；HH-2数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.2工艺流程

茶叶→二次浸提→过滤→茶汁→调配(果葡糖浆)→ 灭菌→ 冷却→ 接种乳酸菌→发酵→ 离心→ 上清液→ 配比(白砂糖)→ 灌装→ 杀菌→ 成品

1.3操作要点

(1)浸提：均采用二次浸提合并法[9]。在茶水比1∶100(g∶mL)，浸提温度95 ℃，浸提10min的条件下浸提茶汤后过滤得到茶汁，过滤的茶渣重复浸提1次，将2次浸提的茶汁合并后备用；

(2)过滤：300目尼龙纱布滤去茶渣；

(3)发酵：调整好成分进行灭菌，冷却后加入菌种恒温发酵；

(4)离心：发酵液于4℃静置5h后离心取上清液备用；

(5)配比：白砂糖调配糖酸比；

(6)灌装杀菌：调配后饮料灌装入已消毒灭菌的玻璃瓶中，密封后在100 ℃水温下灭菌20min。

1.4最佳发酵工艺条件的确定

1.4.1单因素实验

分析果葡糖浆添加量、菌剂接种量、发酵温度和发酵时间对发酵茶饮料品质的影响，以感官评分为主并结合发酵后的pH和酸度评价发酵效果。

1.4.2正交试验

在单因素实验的基础上，以果葡糖浆添加量、接种量、发酵温度和发酵时间为因素进行4因素3水平试验，以感官评分为主并结合发酵后的pH和酸度确定最佳发酵工艺条件，正交试验因素表见表1。

表1　正交试验因素表

1.5分析方法

pH值测定：FE20型pH计；酸度测定：标准碱滴定法(以乳酸计)；可溶性固形物：PAL-1手持式糖度计；茶多酚：酒石酸铁比色法，参照国标GB/T21733—2008。

1.6感官评定

组成10人的感官评定小组对饮料的色泽、风味和口感进行感官评分，总分100分，试验重复3次，取平均值进行计算，评分标准见表2。

表2　产品感官评价标准

1.7风味成分测定方法

取样液约6mL，置于20mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2cm～50/30μmDVB/CAR/PDMSStableFlex纤维头的手动进样器，在60 ℃顶空萃取30min后，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口中，热解析5min。

色谱条件：色谱柱：HP-5；升温程序：50 ℃保持5min，以3 ℃/min升至170 ℃，保持3min，以6 ℃/min升至210 ℃，再以15 ℃/min升至230 ℃，保持1min；载气(He)流速1mL/min，进样口温度：250 ℃，进样方式：不分流，溶剂延迟时间为1min。质谱条件：电子轰击离子源，电子能量70eV；离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃；质量范围m/z 20～450amu。

1.8数据处理

每个实验均重复3次，数据采用Origin9.0作图。GC-MS定性分析通过AgilentMassHunter来完成实验数据的采集和分析，并通过CAS号及配比度确定风味物质的种类；定量分析采用AgilentMassHunter色谱工作站软件，根据色谱图保留峰面积计算出各种香气成分的相对含量。

2　结果与分析

2.1乳酸菌发酵茶饮料的单因素实验

2.1.1果葡糖浆添加量对发酵茶品质的影响

果葡糖浆作为乳酸菌发酵的碳源，其添加量会直接影响乳酸菌的生长情况。添加量过少，乳酸菌生长迟缓，使产品香味不足；添加量过多，渗透压过高阻碍乳酸菌的生长，还会使口感过于甜腻[10]。由图1可知，随着果葡糖浆浓度的增大，pH值缓慢下降之后趋于稳定，酸度反之，感官评分也随着果葡糖浆的增加而提高，当添加量质量浓度为6%时，产品发酵后的平均感官评分最高，之后随着果葡糖浆添加量持续增加，口感偏甜，接受性变差，因此，选择果葡糖浆最佳添加量为6%。

图1　果葡糖浆添加量对酸度、pH和感官评分的影响Fig.1　Effect of syrup content on acidity,pH and sensory score

2.1.2乳酸菌接种量对发酵茶品质的影响

乳酸菌接种量大小直接影响发酵产品的品质，接种量过低，发酵时间较长，产酸量低且容易受到杂菌污染；接种量过高，发酵速度虽能加快但微生物细胞易衰老，出现自溶现象，影响产品风味[11]。

图2　接种量对酸度、pH和感官评分的影响Fig.2　Effect of inoculation on acidity, pH and sensory score

由图2可知，随着接种量的增加，pH值呈现下降的趋势，产品的酸度呈现上升趋势。这是因为接种量的增加使起始发酵液中乳酸菌数增加，产酸能力增强，发酵茶饮料的酸度上升较快，pH下降也较快。从感官评分可以看出，接种量太少会导致口感偏淡，发酵风味不明显，接种量过多产酸较多，饮品酸度较高，难以接受，当接种量质量浓度为0.1%时，平均感官评分最高。考虑到工业化生产成本及能耗，最终选择质量浓度0.1%接种量为最佳条件。

2.1.3发酵温度对发酵茶品质的影响

发酵温度的不同对发酵茶中的乳酸菌生长情况及发酵产品的风味有较大影响。从图3可知，pH值随温度的升高先下降后上升，酸度反之，发酵温度为37 ℃时感官评分最高。植物乳杆菌最适生长温度为37 ℃，在此环境条件下，该菌的生长和代谢旺盛，发酵性能强，发酵后产品口感极佳。因此，选择37 ℃为最佳发酵温度。

图3　发酵温度对酸度、pH和感官评分的影响Fig.3　Effect of fermentation temperature on acidity, pH and sensory score

2.1.4发酵时间对发酵茶品质的影响

发酵时间的长短会直接影响发酵茶产品的口感和风味。由图4可以看出pH值随着发酵时间延长呈现前期迅速下降后期缓慢降低的趋势，酸度反之，发酵36h平均感官评分最高。发酵时间过短，饮品发酵味不足，发酵时间过长，茶饮品闷熟味明显，接受性差。综合感官评分和酸度、pH值及考虑到生产能耗，选择36h为最佳发酵时间。

图4　发酵时间对酸度、pH和感官评分的影响Fig.4　Effect of fermentation time on acidity, pH and sensory score

2.2正交试验结果及分析

在单因素实验的基础上，以果葡糖浆添加量、接种量、发酵时间、发酵温度进行4因素3水平的实验分析，通过感官评分和发酵酸度、pH综合考虑，确定乳酸菌发酵茶饮料的最佳工艺条件，试验结果见表3。

表3　正交试验结果

通过表3的数据和极差分析可知，果葡糖浆添加量(A)、接种量(B)、发酵温度(C)和发酵时间(D)这4个因素对产品感官评分影响的顺序为A>D>C>B。正交实验理论上最佳组合为A3B1C2D2，但在9个试验号中都没有出现，正交表中 A2B3C1D2的感官评定分数最高，其次是A3B1C3D2。因此，选择A3B1C2D2、A2B3C1D2和A3B1C3D2组合重复3次试验进行验证，结果见表4。组合A3B1C2D2的平均感官评分最高，证明正交试验是可信的，结合pH和酸度，考虑到生产成本和能耗，最终选择A3B1C2D2为最优组合，即果葡糖浆添加质量浓度8%、接种量质量浓度0.1%、发酵温度37 ℃、发酵时间36h。

表4　验证试验结果

2.3发酵茶饮料的风味调配

铁观音浸提液发酵后的pH值在3.3左右，口感较酸，需添加糖调节糖酸比。将发酵茶浸提液经4 ℃冷藏5h后，离心得上清液备用。考虑到饮品已含有较多的乳酸，在此不考虑另外加酸，直接用白砂糖进行调配，经感官评定确定调配浓度。从图5感官评定的雷达图可以看出，当白砂糖添加量为2%时产品最受欢迎。

图5　不同白砂糖添加量的感官评定雷达图Fig.5　Radar chart of different amount of sugar

2.4乳酸菌发酵茶饮料挥发性香气成分

挥发性成分是发酵饮料品质的一个重要因素采用HS-SPME/GC-MS法测定乳酸菌发酵铁观音茶饮料发酵前后的挥发性风味成分，结果见表5所示。

铁观音茶浸提液在发酵前后的风味物质变化明显，发酵前检测出香气成分20种，其中醛类4种，醇类、酮类各3种，萜烯类、酸类、烷烃类和含氮化合物各2种，脂类和酚类各1种。醇类、萜烯类和含氮化合物为主要香气成分，分别占香气挥发物总量的12.73%、43.92%和26.97%。香气物质含量较高的有罗勒烯、吲哚和芳樟醇，这些都是铁观音的特征香气成分[12-13]，发酵前茶香明显；发酵后检测出香气成分30种，其中醇类8种，酮类6种，酯类5种，萜烯类和醛类各3种，酸类和含氮化合物各2种，烷烃类1种。醇类、萜烯类和含氮化合物相对含量依然较高，分别为27.3%、30.46%和13.08%，其中除了罗勒烯、吲哚、芳樟醇、2,4,6-三叔丁基苯酚和苯乙腈的相对含量相比于发酵前稍有下降，其他香气成分含量均有上升。此外，新出现的10种物质以醇类和酯类居多，其中香叶基丙酮本身就是茶叶中的香气物质[14-15]，但发酵前却未曾检出，说明通过发酵会增加主体茶香。其他新风味物质中，2-壬醇和丁位十一内酯具有奶油香，肉硅酸戊酯、香叶基丙酮和异戊酸香叶酯具有果香，而二氢茉莉酮和植物醇具有花香。这些物质的形成对发酵茶饮料的风味起到了积极的作用。

表5　发酵茶饮料挥发性风味成分

注：-表示未检出或是匹配度<80

综上所述，茶饮料发酵前主要挥发性成分是醇类、萜烯类和含氮化合物，发酵结束后不仅能保持原茶本身特有的香气，还产生了其他醇类和酯类等挥发性成分。研究报道[16]，醇类物质是微生物在氨基酸代谢中产生的，酯类物质具有水果香，可以在乳酸菌的作用下由醇类和有机酸生成。这些新的风味物质成为了发酵茶饮料独特香气的关键。

2.5乳酸菌发酵茶饮料产品质量标准

2.5.1感官指标

色泽：淡黄色；气味：兼有乳酸菌发酵香味及铁观音特有的茶香，无异味；滋味：口感醇厚，酸甜适中；组织状态：清澈透明，久置后允许有少量沉淀，无分层现象。

2.5.2理化指标

pH值：3.3±0.1，酸度(以乳酸计)：(0.70±0.1)g/L，可溶性固形物≥8.0%，茶多酚≥700mg/kg。

2.5.3微生物指标

细菌总数≤40CFU/mL，大肠菌群≤1CFU/mL，致病菌未检出。

3　结论

本文以pH、酸度和感官评定为指标，通过单因素和正交试验确定了发酵型铁观音茶饮料的最佳发酵工艺参数为：果葡糖浆添加量质量浓度为8%，植物乳杆菌发酵剂接种量为0.1%，发酵温度37 ℃，发酵时间36h；发酵后的饮料经过冷却离心后取上清液，以2%的白砂糖进行调配口感最佳；GC-MS分析表明，醇类、萜烯类和含氮化合物为茶饮料的主要呈香物质，发酵前后检测出香气成分分别为20种和30种，发酵后新物质以醇类和酯类居多，这些物质协同作用，使茶香与发酵香浑然一体，赋予了发酵茶饮料独特的风味。本方法研制的乳酸菌发酵茶饮料，采用单一植物乳杆菌作为发酵剂，打破了传统的混菌种发酵理念，很好的将乳酸菌与茶浸提液合二为一，开发出了工艺操作简单、成本低、品质优和高附加值的饮品，丰富了发酵食品的种类，也为茶饮料的研发提供了新的途径。

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Processoffermentedteabeveragewithlacticacidbacteriaandanalysisofitsaromacomponentsbeforeandafterfermentation

LIUJia-qi,XIONGTao*,LIJun-bo,LIAOLiang-kun,HUANGTao

(StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,SchoolofFoodScienceandTechnology，NanchangUniversity,Nanchang330047,China)

TieguanyinteainfusionwasusedasmainrawmaterialtoproducefermentationteabeveragewithLactobacillus plantarum.Thefermentationconditionswereoptimizedbysinglefactorandorthogonalexperiment.Theheadspacesolid-phasemicroextraction-gaschromatography-massspectrometry(HS-SPME-GC-MS)wasusedtodeterminethearomacompoundsbeforeandafterfermentation.Theoptimumconditionsshowedthattheconcentrationofsyrupwas8%,inoculationamountwas0.1%,fermentationtemperaturewas37 ℃,fermentationtimewas36h.Theresultsofgaschromatography-massspectrometryshowedthatafterfermentation,teabeverageproducedmorevolatileflavorcomponentssuchasalcoholsandesters,whichresultedinteaaromaandlacticacidfermentationaromaofthebeverageatthesametime.Thisproductwasclearandtransparentandpossessedmellowtasteanduniqueflavorafterfiltrationandpreparation.

lacticacidbacteria;fermentationtechnology;teabeverage;flavoringcompositions

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608020

硕士研究生(熊涛教授为通讯作者，E-mail：xiongtao0907@163.com)。

“赣鄱英才555工程”领军人才培养计划(赣才字[2013]2号)；国家农业科技成果转化项目“益生菌高效发酵果蔬饮料绿色技术研究” (赣财农指[2014]120号)；江西省现代农业产业技术体系建设专项(JXARS-06)

2015-12-29,改回日期：2016-03-21